申渝，葛旭萌，白鳳武

1 重慶工商大學(xué)廢油資源化技術(shù)與裝備教育部工程研究中心，重慶 400067

2 大連理工大學(xué)生物科學(xué)與工程系，大連 116023

工業(yè)生物技術(shù)

初始條件對(duì)高濃度乙醇連續(xù)發(fā)酵過程的影響及振蕩行為提高發(fā)酵效率的機(jī)理分析

申渝1,2，葛旭萌2，白鳳武2

1 重慶工商大學(xué)廢油資源化技術(shù)與裝備教育部工程研究中心，重慶 400067

2 大連理工大學(xué)生物科學(xué)與工程系，大連 116023

前期實(shí)驗(yàn)在稀釋速率為0.027 h?1的高濃度乙醇連續(xù)發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)了一種長(zhǎng)周期、寬振幅的參數(shù)振蕩現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了不同稀釋速率下的連續(xù)發(fā)酵過程，發(fā)現(xiàn)在稀釋速率為0.04 h?1條件下，也能出現(xiàn)類似的振蕩現(xiàn)象；在稀釋速率為0.027 h?1或0.04 h?1的條件下，改變系統(tǒng)的初始狀態(tài)可以得到振蕩和穩(wěn)態(tài)兩種不同的發(fā)酵過程。比較振蕩和穩(wěn)態(tài)過程的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)后，發(fā)現(xiàn)在稀釋速率為0.04 h?1的條件下，與穩(wěn)態(tài)過程相比，振蕩過程的平均殘?zhí)菨舛冉档土?4.8%，平均乙醇濃度提高了12.6%，平均設(shè)備生產(chǎn)強(qiáng)度提高了12.3%。進(jìn)一步分析表明：與穩(wěn)態(tài)過程相比，振蕩過程動(dòng)力學(xué)行為不僅存在滯后，而且在相同殘?zhí)呛鸵掖紳舛葪l件下，所對(duì)應(yīng)的平均比生長(zhǎng)速率提高了53.8%。

高濃度乙醇連續(xù)發(fā)酵，振蕩，釀酒酵母，發(fā)酵效率提高

Abstract:Prior research reported the oscillatory behavior characterized by long period and high amplitude during high gravity continuous ethanol fermentations at the dilution rate of 0.027 h?1. In this paper, high gravity continuous ethanol fermentations usingSaccharomyces cerevisiaat different dilution rates were carried out. Similar oscillations were observed when the dilution rate was switched to 0.04 h?1. Both oscillatory and steady processes can be achieved at dilution rates of 0.027 or 0.04 h?1, which depends on the initial status of the fermentation system. However, compared to steady process at the same dilution rate of 0.04 h?1, the average residual sugar concentration was lowered by 14.8% for the oscillatory process, while the average ethanol concentration and productivity were increased by 12.6% and 12.3%, respectively. Further investigation revealed that besides the lag time, oscillatory processes were different from steady ones in kinetics because a higher specific growth rate can be achieved at the same residual sugarand ethanol concentrations (increased by 53.8% in average).

Keywords:very high gravity continuous ethanol fermentation, oscillation,Saccharomyces cerevisia, fermentation efficiency improvement

振蕩現(xiàn)象普遍存在于細(xì)菌、真菌、藻類等多種微生物的連續(xù)培養(yǎng)過程[1-2]。與穩(wěn)態(tài)操作相比，振蕩行為難以預(yù)測(cè)和控制，因此通常選取合適的操作條件加以回避，或開發(fā)相應(yīng)的弱化策略[3]；僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道了振蕩過程中反應(yīng)器生產(chǎn)能力提高的現(xiàn)象，對(duì)振蕩行為的利用則更為罕見[4-5]。

白鳳武等在利用普通釀酒酵母Saccharomyces cerevisia進(jìn)行高濃度乙醇連續(xù)發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)在特定的稀釋速率條件下 (0.027 h?1)，會(huì)出現(xiàn)一種特殊的振蕩現(xiàn)象[6-10]：振蕩周期 (4～7 d) 和振幅 (乙醇濃度變化達(dá)20～40 g/L) 分別是以往報(bào)道的幾十和十幾倍。前期研究通過引入權(quán)值函數(shù)，建立了過程動(dòng)態(tài)模型；隨后利用串聯(lián)裝填填料的管式反應(yīng)器使振蕩得以弱化，并研究了其弱化機(jī)理[8-9]。但仍有以下兩個(gè)關(guān)鍵的問題有待解決：

1) 模擬結(jié)果表明，非穩(wěn)態(tài)過程的參數(shù)特征強(qiáng)烈依賴于初始條件，但此前的振蕩過程均采用相同的起始狀態(tài)，有關(guān)初始條件對(duì)以上連續(xù)發(fā)酵過程穩(wěn)定性 (及振蕩是否產(chǎn)生) 的影響，尚無實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

2) 前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)總稀釋速率為0.012 h?1(相對(duì)于第一級(jí)反應(yīng)器的稀釋速率為 0.027 h?1) 條件下的振蕩過程發(fā)酵效率優(yōu)于總稀釋速率為 0.006 h?1(相對(duì)于第一級(jí)反應(yīng)器的稀釋速率為 0.013 h?1) 條件下的穩(wěn)態(tài)過程[10]，但這并不能說明振蕩過程本質(zhì)上發(fā)酵效率優(yōu)于穩(wěn)態(tài)過程。因?yàn)?，振蕩過程中殘?zhí)呛鸵掖紳舛仍谝欢ǚ秶鷥?nèi)波動(dòng)，其平均發(fā)酵速率實(shí)際上是各時(shí)刻發(fā)酵速率的平均值，由于發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的非線性特征，這一平均值有可能超過在平均殘?zhí)呛鸵掖紳舛葪l件下的發(fā)酵速率，從而造成振蕩過程優(yōu)于穩(wěn)態(tài)過程的假象。因此，需要對(duì)發(fā)酵過程的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

然而，前期實(shí)驗(yàn)采用CSTR與三級(jí)管式反應(yīng)器串聯(lián)的發(fā)酵系統(tǒng)，振蕩優(yōu)于穩(wěn)態(tài)的現(xiàn)象出現(xiàn)在末級(jí)反應(yīng)器，而不是第一級(jí)的CSTR反應(yīng)器[10]。由于末級(jí)反應(yīng)器的發(fā)酵受上一級(jí)反應(yīng)器發(fā)酵參數(shù)的影響，而上一級(jí)反應(yīng)器的發(fā)酵參數(shù)并未測(cè)量，從而無法比較振蕩與穩(wěn)態(tài)過程的動(dòng)力學(xué)。因此，需要重新進(jìn)行不同稀釋速率下的連續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以獲得充分的證據(jù)。

針對(duì)以上問題，本實(shí)驗(yàn)考察了不同稀釋速率下，高濃度乙醇發(fā)酵的穩(wěn)態(tài)和振蕩過程，探索了振蕩產(chǎn)生的必要條件；并對(duì)穩(wěn)態(tài)和振蕩過程的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了比較和分析。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)方法

普通工業(yè)釀酒酵母 ATCC4126，大連理工大學(xué)生物工程系保藏。保存及活化方法見文獻(xiàn)[7]和[8]。

1.2 培養(yǎng)基

一級(jí)種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖30，酵母粉5，蛋白胨3；二級(jí)種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖120，酵母粉5，蛋白胨3；發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖280，酵母粉5，蛋白胨3。

1.3 連續(xù)發(fā)酵

連續(xù)發(fā)酵在一臺(tái)全自動(dòng)攪拌式發(fā)酵罐中進(jìn)行，有效體積為1500 mL。將活化后的一級(jí)種子 (活化方法詳見文獻(xiàn)[8])按10%的比例接入裝有二級(jí)種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐內(nèi)，在 pH 4.5、溫度 30℃、轉(zhuǎn)速300 r/min和通氣量0.05 vvm (無菌空氣) 的條件下培養(yǎng)至殘?zhí)菨舛刃∮? g/L，然后按照設(shè)定的稀釋速率流加發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵，其他操作條件保持不變。具體方案如下：1) 連續(xù)切換稀釋速率，從0.015 h?1開始啟動(dòng)連續(xù)發(fā)酵，運(yùn)行一定時(shí)間以后依次切換 0.025、0.027、0.04、0.06、0.08 h?1；2) 分別培養(yǎng)二級(jí)種子，按稀釋速率0.02、0.03、0.04、0.06、0.08 h?1重新啟動(dòng)連續(xù)發(fā)酵。

以上操作方案中，每種條件下的連續(xù)發(fā)酵至少維持4 d以達(dá)到穩(wěn)態(tài)，或至少經(jīng)歷3個(gè)振蕩周期；然后切換稀釋速率，或進(jìn)行下一批連續(xù)發(fā)酵。

1.4 分析方法

葡萄糖、乙醇和生物量濃度的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 振蕩產(chǎn)生的必要條件

圖1給出了6種稀釋速率下的連續(xù)發(fā)酵依次切換的過程中，殘?zhí)?、乙醇和生物量濃度隨時(shí)間的變化情況。由圖1可見，在稀釋率為0.04 h?1的條件下產(chǎn)生了明顯的振蕩現(xiàn)象，而其他稀釋速率條件下，系統(tǒng)均達(dá)到穩(wěn)態(tài)。

前期實(shí)驗(yàn)中，多次采用0.027 h?1作為起始稀釋速率，均可產(chǎn)生長(zhǎng)周期、寬振幅的振蕩[6-8,10]；本實(shí)驗(yàn)中，在經(jīng)歷稀釋速率為0.015 h?1和0.025 h?1的連續(xù)發(fā)酵后，再將稀釋速率切換至0.027 h?1，卻沒有出現(xiàn)振蕩現(xiàn)象。

然而，當(dāng)稀釋速率由 0.027 h?1切換至 0.04 h?1后，這種長(zhǎng)周期、寬振幅的振蕩再次出現(xiàn)；而隨后進(jìn)行的起始稀釋速率為 0.04 h?1的連續(xù)發(fā)酵過程則達(dá)到了穩(wěn)態(tài) (圖2)。

由此可見，這種振蕩行為的產(chǎn)生不僅依賴于一定的操作條件 (例如稀釋速率)，還依賴于系統(tǒng)的初始狀態(tài)。產(chǎn)生振蕩的條件具體總結(jié)如下：特定稀釋速率，0.027 h?1或0.04 h?1；分別對(duì)應(yīng)特定的初始狀態(tài)，二級(jí)種子培養(yǎng)結(jié)束后直接啟動(dòng)高糖連續(xù)發(fā)酵(0.027 h?1)，高糖連續(xù)發(fā)酵過程中稀釋速率從較低切換到較高值 (0.04 h?1)。

2.2 穩(wěn)態(tài)與振蕩過程的發(fā)酵參數(shù)比較

表1給出了稀釋速率為0.027 h?1和0.04 h?1的條件下，穩(wěn)態(tài)和振蕩過程的平均發(fā)酵參數(shù)。在二級(jí)種子培養(yǎng)完成后直接按 0.027 h?1稀釋速率流加發(fā)酵培養(yǎng)基啟動(dòng)連續(xù)發(fā)酵則產(chǎn)生振蕩，而在稀釋率逐級(jí)遞加的條件下形成穩(wěn)態(tài)；在稀釋速率0.04 h?1時(shí)卻有完全相反的結(jié)果，操作條件直接開始于稀釋率0.04 h?1時(shí)，形成穩(wěn)態(tài)，振蕩只在稀釋率逐級(jí)遞加的條件下發(fā)生 (圖 1)。由表 1可見，在相同稀釋速率條件下，振蕩過程可達(dá)到較低的殘?zhí)菨舛?、較高的乙醇濃度、以及較高的設(shè)備生產(chǎn)強(qiáng)度。具體表現(xiàn)為：在稀釋速率為0.027 h?1的條件下，平均殘?zhí)菨舛冉档?.9%，平均乙醇濃度提高9.0%，平均設(shè)備生產(chǎn)強(qiáng)度提高9.1%；在稀釋速率為0.04 h?1的條件下，平均殘?zhí)菨舛冉档?4.8%，平均乙醇濃度提高12.6%，平均設(shè)備生產(chǎn)強(qiáng)度提高12.3%。

通常對(duì)于穩(wěn)態(tài)的連續(xù)發(fā)酵過程，隨著稀釋速率的降低，系統(tǒng)中的殘?zhí)菨舛葧?huì)進(jìn)一步降低，乙醇濃度進(jìn)一步升高 (如圖1及表1所示)。然而，如表1所示，振蕩過程在相同的稀釋速率下，可達(dá)到比穩(wěn)態(tài)過程更低的殘?zhí)菨舛群透叩囊掖紳舛?；不僅如此，與較低稀釋速率 (0.027 h?1) 下的穩(wěn)態(tài)過程相比，較高稀釋速率 (0.04 h?1) 下的振蕩過程，反而達(dá)到了更低的平均殘?zhí)菨舛群透叩钠骄掖紳舛?。為何振蕩過程的平均發(fā)酵指標(biāo)與穩(wěn)態(tài)過程相比會(huì)有如此顯著的提高？最初推測(cè)：可能是長(zhǎng)時(shí)間(500～600 h) 的連續(xù)發(fā)酵使菌種的發(fā)酵性能有所提高。

圖1 依次切換稀釋速率的連續(xù)發(fā)酵過程中，殘?zhí)恰⒁掖己蜕锪繚舛入S時(shí)間的變化情況Fig.1 Residual sugar (●), ethanol (□) and biomass (○) concentrationvstime during continuous ethanol fermentations at different dilution rates.

表1 稀釋速率分別為0.027 h?1和0.04 h?1條件下的穩(wěn)態(tài)和振蕩過程發(fā)酵參數(shù)比較Table 1 Comparison of fermentation performance between steady and oscillatory processes at the dilution rate of 0.027 h?1and 0.04 h?1

圖2 稀釋速率為0.04 h?1的穩(wěn)態(tài)連續(xù)發(fā)酵過程中，殘?zhí)?、乙醇和生物量隨時(shí)間的變化Fig.2 Residual sugar (●), ethanol (□) and biomass (○)concentrationvstime during continuous ethanol fermentation process at a dilution rate of 0.04 h?1.

分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：圖 1中稀釋速率在 0.06 h?1和0.08 h?1下的穩(wěn)態(tài)發(fā)酵過程參數(shù)，是在系統(tǒng)連續(xù)運(yùn)行了900 h之后得到的。為考察運(yùn)行時(shí)間對(duì)菌種發(fā)酵性能的影響，隨后進(jìn)行了起始稀釋速率分別為0.06 h?1和0.08 h?1的連續(xù)發(fā)酵過程，雖然運(yùn)行時(shí)間僅為300 h(均為穩(wěn)態(tài)，數(shù)據(jù)未顯示)，但與運(yùn)行時(shí)間超過 900 h的發(fā)酵過程 (稀釋速率分別為 0.06 h?1和 0.08 h?1)相比，其殘?zhí)菨舛炔o顯著差異，未發(fā)現(xiàn)菌種的發(fā)酵性能在長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)發(fā)酵后有明顯改變。因此，上述振蕩過程平均發(fā)酵指標(biāo)高于穩(wěn)態(tài)過程的現(xiàn)象，其原因不在于菌種性能的差異，而在于過程本身。

2.3 振蕩過程與穩(wěn)態(tài)過程的動(dòng)力學(xué)及差異

對(duì)于采用CSTR反應(yīng)器的連續(xù)發(fā)酵過程，系統(tǒng)的稀釋速率等于細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率；而比生長(zhǎng)速率與底物和產(chǎn)物濃度有關(guān)[11-12]，通常表示為μ=f(Cs,Cp) 的非線性函數(shù)形式。理論上存在同一比生長(zhǎng)速率對(duì)應(yīng)不同殘?zhí)呛鸵掖紳舛鹊目赡?；而且與穩(wěn)態(tài)過程相比，振蕩過程中的殘?zhí)呛鸵掖紳舛仍谳^大范圍內(nèi)波動(dòng)，由于非線性函數(shù)的均值可能大于其自變量均值的函數(shù)值，因此振蕩過程中的平均比生長(zhǎng)速率有可能大于相同平均殘?zhí)菨舛群推骄掖紳舛葪l件下穩(wěn)態(tài)過程的比生長(zhǎng)速率。以上兩種原因均可能導(dǎo)致更高稀釋速率對(duì)應(yīng)更低殘?zhí)菨舛群透咭掖紳舛鹊默F(xiàn)象，但取決于細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的具體形式。為此，本研究考察了高濃度乙醇連續(xù)發(fā)酵過程的動(dòng)力學(xué)特征。

表2給出了高濃度乙醇連續(xù)發(fā)酵過程中，不同稀釋速率下的穩(wěn)態(tài)過程實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。由表2可見，在殘?zhí)菨舛群鸵掖紳舛葹?1.3～167.1 g/L和49.9～78.9 g/L的范圍內(nèi) (包括了振蕩過程所經(jīng)歷的殘?zhí)呛鸵掖紳舛确秶?6～129 g/L和65.9～78.6 g/L)，比生長(zhǎng)速率與殘?zhí)菨舛日嚓P(guān)，與乙醇濃度負(fù)相關(guān)，未發(fā)現(xiàn)同一比生長(zhǎng)速率對(duì)應(yīng)不同殘?zhí)菨舛群鸵掖紳舛鹊默F(xiàn)象。

通過數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)表2中的殘?zhí)菨舛?(Cs) 與乙醇濃度 (Cp) 之間具有以下線性關(guān)系：

因此，基于表2數(shù)據(jù)的動(dòng)力學(xué)模型可簡(jiǎn)化為具有單一自變量的函數(shù)形式，具體為：

表2 連續(xù)發(fā)酵穩(wěn)態(tài)過程實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 2 Experimental data of continuous ethanol fermentation at steady states

對(duì)于圖1中稀釋速率為0.04 h?1的振蕩過程，殘?zhí)菨舛?(Cs) 與乙醇濃度 (Cp) 之間也具有與方程(1) 近似相同的線性關(guān)系：

若該振蕩過程各時(shí)刻的動(dòng)力學(xué)與穩(wěn)態(tài)過程相同，則各數(shù)據(jù)點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的比生長(zhǎng)速率可用公式 (2)估算。圖3比較了稀釋速率為0.04 h?1的振蕩過程中，各時(shí)刻比生長(zhǎng)速率的實(shí)測(cè)值和由公式 (2) 得到的計(jì)算值。

圖 3 稀釋速率為 0.04 h?1的振蕩過程中比生長(zhǎng)速率實(shí)測(cè)值與計(jì)算值的比較Fig.3 Comparison of the experimental data (●) with the data predicted by model (○) for specific cell growth rates during oscillation process at the dilution rate of 0.04 h?1.

由圖 3可見，振蕩過程中實(shí)際的比生長(zhǎng)速率明顯高于按照穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)得到的計(jì)算值，且存在時(shí)間上的平移。因此，振蕩過程各時(shí)刻的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)與穩(wěn)態(tài)并不相同，對(duì)于稀釋速率為0.04 h?1的振蕩過程，在經(jīng)歷相同的殘?zhí)呛鸵掖紳舛葪l件下，其平均比生長(zhǎng)速率 (0.04 h?1) 比穩(wěn)態(tài)過程 (0.026 h?1)提高了53.8%。

對(duì)于振蕩過程與穩(wěn)態(tài)過程動(dòng)力學(xué)差異的報(bào)道，主要涉及細(xì)胞對(duì)環(huán)境脅迫的延遲反應(yīng) (滯后)，即細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率不僅與當(dāng)前時(shí)刻的底物和產(chǎn)物濃度有關(guān)，而且與前面時(shí)刻的底物和產(chǎn)物濃度有關(guān)，雖然利用權(quán)值函數(shù)可模擬這種滯后現(xiàn)象，但比生長(zhǎng)速率的平均值仍與穩(wěn)態(tài)過程相同[13-14]。也有報(bào)道表明，細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率受乙醇濃度升高速率的負(fù)面影響，但其結(jié)果是振蕩過程的平均比生長(zhǎng)速率低于穩(wěn)態(tài)過程[15-17]。對(duì)于實(shí)驗(yàn)中振蕩過程提高發(fā)酵效率和平均比生長(zhǎng)速率的現(xiàn)象，除了利用數(shù)學(xué)模型來解釋以外，較為合理的解釋是：抑制型產(chǎn)物連續(xù)發(fā)酵過程中，產(chǎn)物濃度周期性變化給細(xì)胞提供了恢復(fù)活性的時(shí)間，因此能夠在平均產(chǎn)物濃度相同的條件下保證較高的平均比生長(zhǎng)速率；乙醇屬于初級(jí)代謝產(chǎn)物，細(xì)胞平均比生長(zhǎng)速率提高發(fā)酵效率也就提高。類似振蕩現(xiàn)象在其他產(chǎn)物抑制型連續(xù)發(fā)酵過程也有報(bào)道[13,15,18]，但是由于缺少相應(yīng)條件下穩(wěn)態(tài)過程的數(shù)據(jù)，還不能證明其他過程是否也存在提高平均比生長(zhǎng)速率和發(fā)酵效率的現(xiàn)象。

3 結(jié)論

1) 高濃度乙醇連續(xù)發(fā)酵過程中的振蕩行為的產(chǎn)生與操作條件和系統(tǒng)的初始狀態(tài)有關(guān)；

2) 在相同稀釋速率下，與穩(wěn)態(tài)過程相比，振蕩過程具有更低的殘?zhí)菨舛?、更高的乙醇濃度和更高的設(shè)備生產(chǎn)強(qiáng)度；

3) 與穩(wěn)態(tài)過程相比，振蕩過程的動(dòng)力學(xué)不僅存在滯后，而且經(jīng)歷相同殘?zhí)呛鸵掖紳舛葪l件下，振蕩過程的平均比生長(zhǎng)速率明顯高于穩(wěn)態(tài)過程。

符 號(hào) 說 明

Cs—— 殘?zhí)菨舛?，g/L；

P——設(shè)備生產(chǎn)強(qiáng)度，g/(L·h)；

Cp—— 乙醇濃度，g/L；

t—— 時(shí)間，h；

Cx—— 生物量濃度 (干重)，g/L；

Yp/s—— 產(chǎn)物對(duì)底物得率，g/g；

CSTR —— 連續(xù)攪拌式反應(yīng)器；

μ——比生長(zhǎng)速率，h?1；

D——稀釋速率，h?1。

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Impact of fermentation system initial status on oscillations in very high gravity ethanol continuous fermentation process and analysis of fermentation efficiency improvement

Yu Shen1,2, Xumeng Ge2, and Fengwu Bai2

1Engineering Research Center for Waste Oil Recovery Technology and Equipment,Ministry of Education,Chongqing Technology and Business University,Chongqing400067,China
2Department of Bioscience and Bioengineering,Dalian University of Technology,Dalian116023,China

Received:December 24, 2009;Accepted:February 2, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA10Z358), National Natural Science Foundation of China (No. 20806014), Initial Science Foundation of Chongqing Technology and Business University (No. 09-56-05).

Corresponding author:Yu Shen. Tel: +86-23-62768317; E-mail: 1981shenyu@sohu.com

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2007AA10Z358)，國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (No. 20806014)，重慶工商大學(xué)科研啟動(dòng)項(xiàng)目 (No. 09-56-05)資助。