徐小曼，王嘯辰，馬翠卿

1 山東大學(xué) 微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100

2 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610065

細(xì)胞工廠的構(gòu)建技術(shù)

芽胞表面展示技術(shù)研究進(jìn)展

徐小曼1，王嘯辰2，馬翠卿1

1 山東大學(xué) 微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100

2 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610065

芽胞表面展示技術(shù)作為微生物表面展示技術(shù)的一種，因所表達(dá)的異源蛋白無需經(jīng)過跨膜過程及芽胞的抗逆性等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)而備受研究者的關(guān)注。以下介紹了芽胞的生理結(jié)構(gòu)和形成過程、芽胞表面展示系統(tǒng)構(gòu)建原則及目前所構(gòu)建的芽胞表面展示系統(tǒng)種類。芽胞表面展示技術(shù)不僅在疫苗生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，在生物催化和細(xì)胞工廠研究領(lǐng)域也具有廣闊的應(yīng)用前景。

芽胞，芽胞表面展示，生物催化

Abstract:Spore surface display is one of attractive microorganism surface display systems. With the advantage of resistance attribute and specific assembly pattern, the technology of spore surface display now is attracting more and more attention. According to the current reports and main achievements of spore surface display, the structure and assembly of spores, the principle for construction and some existing spore surface display systems were elaborated in this paper. Now with the unique property of spores,the technique is not only widely used in production of vaccines but also has great applied potential in the field of biocatalysis and cell-factory.

Keywords:spore, spore surface display, biocatalysis

表面展示 (Surface display) 是一種有價(jià)值的基因操作技術(shù)，它使表達(dá)的外源肽 (或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域) 以融合蛋白形式展現(xiàn)在噬菌體或細(xì)胞的表面，被展示的多肽或蛋白質(zhì)可以保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，因而可以用于多肽性質(zhì)、相互識(shí)別和作用的研究，以及構(gòu)建大型的展示庫(kù)。

第一個(gè)表面展示系統(tǒng)由Geroge P. Smith等于1985年建立，他利用絲狀噬菌體M13的pIII蛋白將抗體固定在噬菌體表面，為抗原的生產(chǎn)提供了一種新的技術(shù)和方法[1]。該實(shí)驗(yàn)的成功使表面展示系統(tǒng)引起了研究學(xué)者們?cè)絹碓綇V泛的關(guān)注，并建立了多樣的表面展示系統(tǒng)，如噬菌體表面展示系統(tǒng)[2]、酵母表面展示系統(tǒng)[3]、細(xì)菌表面展示系統(tǒng)[4]和新發(fā)展起來的芽胞表面展示系統(tǒng)[1]。與噬菌體和細(xì)胞等表面展示系統(tǒng)相比，雖然芽胞表面展示系統(tǒng)起步較晚，但具有表達(dá)過程更為簡(jiǎn)捷有效的優(yōu)點(diǎn)。由于芽胞具有特殊的生理結(jié)構(gòu)，使得融合蛋白在固定到表面的過程中無需經(jīng)過穿膜過程，大大增加了融合蛋白正確折疊和有效定位的效率，同時(shí)借助芽胞的抗逆特性還可提高異源蛋白的穩(wěn)定性[5]。此外，芽胞表面展示系統(tǒng)可固定多聚體蛋白在芽胞表面，并且不影響其活性，為多聚體蛋白的應(yīng)用提供了一種新的方法[6]。

目前芽胞表面展示技術(shù)的應(yīng)用較為廣泛。在活疫苗和抗體生產(chǎn)方面，可用于將異源抗原決定簇固定在芽胞表面來引起特定抗原的抗體免疫應(yīng)答。芽胞良好的抗逆性使疫苗能夠耐受胃液中的酸性環(huán)境，儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)，可順利通過胃腸屏障，快速誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。在蛋白或多肽的高通量篩選方面，借助芽胞的特殊組裝機(jī)制和抗逆特性，可有效增加結(jié)合和淘洗的過程中所展示蛋白或多肽的穩(wěn)定性。此外，芽胞表面展示技術(shù)還應(yīng)用于化學(xué)物質(zhì)和重金屬的生物吸附、構(gòu)建生物傳感器等方面(圖1)[7]。隨著科技的不斷發(fā)展和進(jìn)步，芽胞表面展示技術(shù)在不斷的變化更新，其應(yīng)用的領(lǐng)域和范圍也在逐漸擴(kuò)大。

圖 1 芽胞基本結(jié)構(gòu)以及芽胞表面展示技術(shù)的應(yīng)用[6,8,16,18,21,23]Fig.1 Structure of spore and application of spore surface display[6,8,16,18,21,23].

1 芽胞的組成

芽胞是有些細(xì)菌在饑餓或者環(huán)境惡劣的情況下形成的一種圓形或橢圓形的休眠體，以抵抗不良環(huán)境。芽胞從外至內(nèi)的結(jié)構(gòu)為孢子外壁、芽胞衣、外膜、皮層、內(nèi)膜和核心[8]，每部分行使不同的功能。芽胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成在芽胞的抗逆性中起到了重要的作用。

孢子外壁是一層疏松的結(jié)構(gòu)，存在于少數(shù)特定的孢子外層，尤其是蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus屬。芽胞衣是由多個(gè)分層和超過50種蛋白組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，以規(guī)則嚴(yán)密的矩陣形式自組裝形成，并且多數(shù)蛋白都是芽胞基因特有的表達(dá)產(chǎn)物。芽胞衣使芽胞對(duì)化學(xué)試劑和外部溶菌酶具有抵抗作用，防止含有染色體的核心被降解或被原生動(dòng)物吞噬，但對(duì)熱、輻射和一些其他的化學(xué)試劑的抵抗作用并不明顯[9-10]。外膜位于芽胞衣的內(nèi)側(cè)，是芽胞形成不可或缺的結(jié)構(gòu)，但具體功能目前尚不明確。與芽胞的外膜相比，芽胞內(nèi)膜是具有選擇性的透性屏障，保護(hù)芽胞染色體DNA免于被一些化學(xué)試劑破壞。在芽胞中，內(nèi)膜呈現(xiàn)為一種緊密壓縮的狀態(tài)。

芽胞的皮層和核心是休眠孢子形成和保持較低水分的關(guān)鍵因素。皮層主要是由肽聚糖 (PG) 組成，其結(jié)構(gòu)與生長(zhǎng)細(xì)胞中的肽聚糖結(jié)構(gòu)類似但具有特殊的后修飾。當(dāng)芽胞開始萌發(fā)時(shí)，皮層會(huì)被降解，為核心的膨脹和后續(xù)的細(xì)胞生長(zhǎng)提供空間[8,11]。芽胞的最內(nèi)層是核心，含有大部分的酶、染色體DNA、核糖體和tRNA。大部分情況下，芽胞核心中的酶和核酸與生長(zhǎng)細(xì)胞中基本相同，但芽胞核心中的自由水含量非常低，并含有一種特殊的小分子——嘧啶-2,6-二羧酸 (DPA)。DPA的主要作用是在芽胞形成的過程中降低核心的含水量，并且保護(hù)芽胞染色體免于受紫外光和化學(xué)物質(zhì)的破壞[8]。

2 芽胞的形成

芽胞的形成是一系列調(diào)控基因和結(jié)構(gòu)基因嚴(yán)格按照時(shí)序性和空間性調(diào)控表達(dá)的過程。部分外界因素主要是細(xì)胞密度和營(yíng)養(yǎng)環(huán)境會(huì)影響芽胞的形成，而外部環(huán)境的改變最終影響到內(nèi)部環(huán)境中芽胞形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白Spo0A的表達(dá)狀態(tài)，當(dāng)Spo0A的含量和磷酸化水平達(dá)到一定閾值時(shí)，可直接或間接調(diào)節(jié)菌體內(nèi)的多個(gè)基因表達(dá)，促使芽胞的形成[12-13]。

芽胞的整個(gè)形成過程從開始到結(jié)束大約需要8～10 h左右。大致可分為7個(gè)步驟。首先當(dāng)遇到惡劣環(huán)境時(shí)細(xì)胞開始形成休眠孢子以抵御外界不良環(huán)境，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)的σ因子的活力開始增加，隨后細(xì)胞被特定不均勻的隔膜進(jìn)行不等分裂，形成一個(gè)大的母細(xì)胞和一個(gè)小的前芽胞，這時(shí)在前芽胞中σF因子開始活躍，而在母細(xì)胞中則是σE因子。不均等分裂完成后，母細(xì)胞的質(zhì)膜逐漸包裹前芽胞，使前芽胞的外部包裹兩層膜結(jié)構(gòu)，隨后被激活或合成的具有特定空間作用的 σG因子和 σK因子開始誘導(dǎo)前芽胞和母細(xì)胞中的基因表達(dá)，在前芽胞的內(nèi)外兩層膜中合成一層厚的糖蛋白皮層。在此過程中由 GerE蛋白和 σK因子相互協(xié)作共同引導(dǎo)基因表達(dá)的最后階段，同時(shí)前芽胞質(zhì)體的水分含量大大降低，從而使前芽胞內(nèi)的pH值降低。前芽胞在此后的過程中逐漸充滿在母細(xì)胞中合成的 DPA，DPA可使得前芽胞在后續(xù)過程中繼續(xù)脫水。隨后在芽胞衣蛋白CotE、CotG和CotB的相互作用下，芽胞衣逐漸形成，覆蓋在芽胞外；最后，母細(xì)胞被裂解釋放出成熟的芽胞[9]。

3 芽胞表面展示系統(tǒng)

在過去10年中，由于芽胞的特殊結(jié)構(gòu)和生理性質(zhì)，芽胞表面展示已成為抗體生產(chǎn)和酶催化的一種實(shí)用新型技術(shù)。2001年，Pozzi課題組以CotB為錨定蛋白將破傷風(fēng)毒素展示在枯草芽胞桿菌芽胞表面，建立了第一個(gè)芽胞表面展示系統(tǒng)，提供了一種新型高效的抗原免疫模式[14]。與其他表面展示系統(tǒng)相比，芽胞表面展示系統(tǒng)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：1) 客體蛋白在表面展示的過程中不需穿膜過程，因此提高了蛋白折疊效率和展示效率。2) 可展示分子量較大的蛋白。3) 可展示多聚體蛋白。4) 芽胞特有的抗逆性可增加客體蛋白的應(yīng)用范圍[1]。

目前芽胞表面展示系統(tǒng)中的宿主應(yīng)用最多的是枯草芽胞桿菌芽胞，因?yàn)槟壳翱莶菅堪麠U菌的芽胞研究的最為詳細(xì)，并具有完整的基因組信息和完善的遺傳操作體系，便于重組芽胞的構(gòu)建；同時(shí)枯草芽胞桿菌是公認(rèn)的益生菌，安全性高，可廣泛應(yīng)用于食品和藥品領(lǐng)域[14-15]。除枯草芽胞桿菌外，蘇云金芽胞桿菌、炭疽芽胞桿菌、嗜熱脂肪芽胞桿菌等也都曾被用作芽胞表面展示系統(tǒng)的宿主。

3.1 芽胞表面展示系統(tǒng)構(gòu)建原則

芽胞表面展示系統(tǒng)由載體蛋白、目的蛋白和宿主 3部分組成，每一部分都是表面展示系統(tǒng)構(gòu)建成功的關(guān)鍵，因此三者的選擇非常重要。

20世紀(jì)90年代，許多不同的載體蛋白 (錨定基序) 被用于異源蛋白的表面展示，但部分被應(yīng)用的細(xì)胞功能蛋白或結(jié)構(gòu)蛋白，如外膜蛋白和細(xì)胞附屬物的亞基，可導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)缺陷和細(xì)胞膜不穩(wěn)定。一個(gè)成功的載體蛋白必須符合4項(xiàng)要求。首先，它必須具有一個(gè)結(jié)構(gòu)域可使異源蛋白展示在芽胞的表面；其次，它必須具有一個(gè)強(qiáng)大的錨定結(jié)構(gòu)域，以保證融合蛋白能夠固定在細(xì)胞表面而不被分開；第三，載體蛋白和外源蛋白必須兼容，可以形成融合蛋白，而不會(huì)出現(xiàn)由于外源蛋白的插入使載體蛋白或芽胞不穩(wěn)定的現(xiàn)象；最后，載體蛋白必須具有一定抵抗培養(yǎng)基或周質(zhì)空間中蛋白酶的能力[7]。不同的載體蛋白具有不同的性質(zhì)特點(diǎn)，可根據(jù)具體的展示系統(tǒng)來選擇。目前用于枯草芽胞桿菌芽胞表面展示的載體蛋白主要為CotB、CotC和CotG，研究表明這些蛋白的缺失不會(huì)影響芽胞的形成和正常的出芽。

芽胞表面展示系統(tǒng)中的目的蛋白又稱為客體蛋白，被展示在芽胞表面的客體蛋白是根據(jù)需要而選擇的，但客體蛋白本身也可影響整個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)過程以及最終的表面展示結(jié)果。芽胞表面展示系統(tǒng)對(duì)客體蛋白的要求較低，不僅可展示分子量較大的蛋白還可展示多聚體蛋白，并且在展示到表面的過程中不影響蛋白的自身活力。

在表面展示系統(tǒng)中，宿主所起到的重要作用是不能忽略的。一個(gè)好的宿主必須能和客體蛋白兼容，易于培養(yǎng)而不被裂解，并且與細(xì)胞壁相關(guān)的蛋白酶和胞外蛋白酶的活力應(yīng)盡量低[7]。芽胞是桿狀菌和梭菌在環(huán)境惡劣的情況下形成的一種休眠體結(jié)構(gòu)，芽胞作為具有代謝能力的特殊結(jié)構(gòu)，也可作為表面展示的宿主并具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在芽胞表面展示時(shí)，可根據(jù)需要選擇芽胞宿主。若固定的異源蛋白是用于進(jìn)行免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn)和疫苗的生產(chǎn)，或是用于生產(chǎn)醫(yī)藥、食品化合物和中間體等生物安全性要求較高的領(lǐng)域，可選擇枯草芽胞桿菌作為芽胞表面展示的宿主菌株，因其是公認(rèn)的益生菌，安全性較高。另外根據(jù)特殊的需要，一些致病菌株如蘇云金芽胞桿菌、炭疽芽胞桿菌也可作為表面展示的宿主。

3.2 枯草芽胞桿菌芽胞表面展示系統(tǒng)

芽胞表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建主要是基于外源DNA與芽胞衣蛋白DNA的基因融合。目前，芽胞外衣蛋白中已證實(shí)可用作錨定蛋白的有 3種，分別為CotB、CotC和CotG。這3類蛋白常以多聚體的形式存在于富含酪氨酸的芽胞衣外層中。cotB基因編碼一段大小為46 kDa的多肽，在經(jīng)過翻譯后修飾變?yōu)?6 kDa。CotC是一個(gè)分子量只有8.8 kDa的小蛋白，富含酪氨酸、賴氨酸和天冬氨酸，而CotG是分子量為24 kDa的蛋白，在核心區(qū)含有9個(gè)甘氨酸-絲氨酸-精氨酸的重復(fù)序列。對(duì)于CotG和CotC而言，它們的整個(gè)序列常被用作錨定基序，而對(duì)于CotB通常只涉及其中很短的一段序列[1,14,16]。目前，大多數(shù)的表面展示系統(tǒng)是利用CotB和CotC作為錨定蛋白來展示抗原，應(yīng)用于疫苗免疫等領(lǐng)域，而CotG蛋白不僅可用來展示抗原，還可應(yīng)用于生物催化領(lǐng)域展示不同酶。

第一個(gè)芽胞表面展示系統(tǒng)是以 CotB為錨定蛋白，將具有高免疫原性的模式抗原破傷風(fēng)毒素C末端 (TTFC) 展示在了枯草芽胞桿菌芽胞的表面。由459個(gè)氨基酸組成的破傷風(fēng)毒素分別與CotB的N末端、有所縮短的C末端相連或直接插入到 CotB序列中間，隨后將展示有 TTFC的芽胞用于進(jìn)行小鼠口腔和鼻內(nèi)免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)證明重組芽胞可同時(shí)引起鼠科動(dòng)物粘膜和全系統(tǒng)的免疫應(yīng)答[14]。隨后，有研究者將表面展示有CotB-TTFC融合蛋白的芽胞在小鼠的體內(nèi)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)小鼠血清中 TTFC特異性抗體IgG產(chǎn)生了高水平應(yīng)答[17]。

除 CotB外，2004年英國(guó)皇家霍洛威大學(xué)的Cutting課題組利用芽胞外衣蛋白CotC展示了TTFC和LTB (大腸桿菌不耐熱腸毒素)。通過基因融合的方式將TTFC和LTB的基因插入至cotC基因的C末端，并利用染色體重組技術(shù)將融合基因插入枯草芽胞桿菌淀粉酶基因的位置，得到可穩(wěn)定遺傳的重組菌株。通過體外注射的形式將表面展示有 TTFC和LTB的芽胞注入小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)CotC-TTFC重組芽胞不僅可引起局部免疫反應(yīng)還可產(chǎn)生系統(tǒng)免疫反應(yīng)，而對(duì)于CotC-LTB重組芽胞，其局部免疫應(yīng)答比全身免疫應(yīng)答更為有效。與 CotB-TTFC相比，CotC-TTFC重組芽胞在進(jìn)行小鼠口服免疫實(shí)驗(yàn)時(shí)的劑量低了2倍，但同樣可產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。然而對(duì)于CotB-TTFC重組芽胞可抵抗50倍抗毒素半數(shù)致死量的能力，CotC-TTFC重組芽胞20倍的抵抗能力顯得稍弱。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)，體外注射的一小部分完整芽胞可穿過黏膜到達(dá)派氏淋巴結(jié)，并可與腸道相關(guān)淋巴組織相互作用，芽胞的這種能力對(duì)細(xì)胞內(nèi)的免疫反應(yīng)具有重要的指導(dǎo)意義[18]。

中國(guó)廣州中山大學(xué)的Yu課題組同樣利用CotC將華支睪吸蟲外殼蛋白TP20.8展示在枯草芽胞桿菌芽胞的表面，并將重組的芽胞以口服的形式注入小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了黏膜應(yīng)答，并且提高了 IgA的分泌水平。IgA在動(dòng)物體內(nèi)具有重要的生理作用，它可聚集病原體、抑制病原體的移動(dòng)、防止其與上皮細(xì)胞的發(fā)生吸附。因此，芽胞表面展示系統(tǒng)可作為防止和控制寄生蟲的有效免疫工具[19]。

2005年，韓國(guó)Kim課題組以CotG為載體蛋白，將鏈霉菌的鏈霉毒素基因插入cotG基因的C末端，然后將鏈霉毒素以融合蛋白的形式展示在枯草芽胞桿菌芽胞表面。鏈霉毒素的活性形式同四聚體，并且在活性蛋白中具有 4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)。生物素是生物體內(nèi)重要的生理活性物質(zhì)，易與蛋白、核酸和碳水化合物等生物分子相結(jié)合，因此利用展示有鏈霉毒素的芽胞可非常有效地檢測(cè)與生物素相結(jié)合的生物分子。就目前鏈霉毒素的生產(chǎn)方法，其DNA序列中的高 GC含量、細(xì)胞內(nèi)生物素的結(jié)合以及四聚體的活性形式都限制了鏈霉毒素的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)及活性分子的分泌，而利用芽胞表面展示系統(tǒng)可有效解決這些問題[16]。2006年，該課題組又以CotG為載體蛋白將綠色熒光蛋白 (GFP) 展示在芽胞表面，GFP在紫外光的激發(fā)下可產(chǎn)生綠色熒光，表面展示有 GFP的芽胞在紫外線下有熒光出現(xiàn)而沒有 GFP的芽胞則沒有熒光產(chǎn)生。根據(jù)這一特性，GFP可作為報(bào)告基因，用于鑒定其他的可用作錨定基序的外層芽胞衣蛋白[20]。

除了用于展示抗原外，芽胞表面展示系統(tǒng)也可用于生物催化過程。2007年韓國(guó)Pan課題組以CotG為載體蛋白將大腸桿菌的 β-半乳糖苷酶展示在枯草芽胞桿菌芽胞表面。具有生物活性的 β-半乳糖苷酶是以同四聚體的形式存在的，每個(gè)單體的分子量為116 kDa，常被用作生物學(xué)研究中的報(bào)告蛋白。表面展示有 β-半乳糖苷酶的芽胞經(jīng)由流式細(xì)胞儀檢測(cè)和蛋白酶可及性測(cè)試 (Protease accessibility test) 驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于其他的細(xì)菌表面展示系統(tǒng)，芽胞表面展示系統(tǒng)對(duì)展示的客體蛋白沒有大小和多聚體的限制。β-半乳糖苷酶除了可水解乳糖為葡萄糖和半乳糖外，還可催化水-有機(jī)溶劑兩相系統(tǒng)中的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，產(chǎn)生烷基-β-半乳糖苷——一種具有抗微生物活性的藥物中間體。與游離的 β-半乳糖苷酶相比，展示在芽胞表面的 β-半乳糖苷酶在有機(jī)溶劑，尤其是乙醚、甲苯、乙酸乙酯及乙腈中的穩(wěn)定性大大增加，同時(shí)熱穩(wěn)定性也有所增加。通過芽胞表面展示的方法，不僅酶在有機(jī)溶劑中低穩(wěn)定性的問題得到了有效解決，而且還消除了由于酶和底物分散在兩相引起的傳質(zhì)問題[1,6]。

3.3 其他芽胞表面展示系統(tǒng)

在土壤中存在很多桿菌尤其是腐生物，大多數(shù)不是致病菌，但是蠟樣芽胞桿菌B. cereus、炭疽芽胞桿菌B. anthracis和蘇云金芽胞桿菌B. thutringiensis對(duì)動(dòng)物和昆蟲是病原微生物。這些病原微生物與腐生物的芽胞結(jié)構(gòu)與枯草芽胞桿菌芽胞的結(jié)構(gòu)不同，在其最外層有一層孢子外壁。孢子外壁包裹在芽胞衣外，由基本的類晶體層和外部毛發(fā)般的絨毛組成[1]。孢子外壁中的一些蛋白同樣可作為表面展示系統(tǒng)中的載體蛋白，并且已有成功的報(bào)道。

2008年，美國(guó)密蘇里州立大學(xué)的研究者們分別克隆了不同長(zhǎng)度的炭疽芽胞桿菌孢子外壁類糖蛋白BclA和BclB的基因，將其連入芽胞表面展示的表達(dá)載體中，以BclA的啟動(dòng)基因?yàn)閱?dòng)子，以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因，驗(yàn)證了BclA和BclB作為表面展示系統(tǒng)中錨定蛋白的功能，同時(shí)還闡述了BclA在孢子外壁中的組裝模式。該研究發(fā)現(xiàn)BclA的N末端對(duì)蛋白在芽胞表面的定位起著至關(guān)重要的作用，而C末端的最后35個(gè)氨基酸不是BclA行使生物功能的必須區(qū)域，可作為外源蛋白的替代區(qū)域；與BclA不同，BclB在母細(xì)胞中的含量較少，并且組裝機(jī)制與BclA不同，可能與其N末端的結(jié)構(gòu)有關(guān)，但這并不影響其在芽胞表面展示系統(tǒng)中行使錨定蛋白的功能。利用炭疽芽胞桿菌芽胞表面展示系統(tǒng)所固定的疫苗，在抵抗炭疽熱和其他具有生物威脅性的試劑方面更為安全有效，使炭疽芽胞桿菌成為極具前途的重組疫苗運(yùn)輸載體之一。此外，使用芽胞作為疫苗載體可同時(shí)引發(fā)Th1和Th2免疫反應(yīng)，而現(xiàn)有的AVA疫苗則不能，因此將某些異源蛋白如具生物威脅性個(gè)體 (Biothreat agents) 的表面蛋白展示在芽胞的表面，可有效建立針對(duì)一系列病原微生物的多樣疫苗[21]。

除炭疽芽胞桿菌外，蘇云金芽胞桿菌芽胞也可作為芽胞表面展示系統(tǒng)中的宿主[22-23]。2004年，韓國(guó)Choi課題組首次以蘇云金芽胞桿菌芽胞為載體，展示了綠色熒光蛋白，并借助酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、微陣列技術(shù)和微接觸印刷技術(shù)，構(gòu)建芽胞微模式模型 (Micro pattern)。微模式在高通量細(xì)胞分析系統(tǒng)、高靈敏細(xì)胞生物傳感器的建立和稀有元素的探測(cè)方面具有巨大的發(fā)展?jié)摿?，而芽胞微模式在傳感器和探測(cè)器領(lǐng)域與傳統(tǒng)的細(xì)胞微模式相比，具有更的高穩(wěn)定性并且便于操作，因此芽胞表面展示技術(shù)在生物傳感方面的應(yīng)用前景也十分廣闊[23]。

蘇云金芽胞桿菌的芽胞含有一個(gè)大小為130 kDa的原毒素蛋白，是芽胞層的重要組成部分，屬于殺蟲晶體蛋白Cry1Ac亞群，形成最初位于孢子外壁的伴孢晶體。有學(xué)者推測(cè)伴孢晶體的N末端暴露在芽胞表面，而C末端則在芽胞衣內(nèi)與蛋白相連。目前GFP和識(shí)別化學(xué)組分的單鏈抗體 (ScFv) 這兩種客體蛋白通過替代載體蛋白N末端、形成融合蛋白的方法已成功展示在芽胞表面[24]。利用蘇云金芽胞桿菌芽胞進(jìn)行表面展示的優(yōu)勢(shì)一方面是其產(chǎn)孢率較高，產(chǎn)孢率可達(dá)98%～100%；另一方面客體蛋白僅存在于伴孢晶體，而伴孢晶體并不是整個(gè)芽胞所必須的結(jié)構(gòu)，因此其展示的空間不受限制，而在枯草芽胞桿菌芽胞表面展示系統(tǒng)中融合蛋白與其原始的芽胞衣蛋白在空間上存在競(jìng)爭(zhēng)作用，因此展示效率低于蘇云金芽胞表面展示系統(tǒng)[1,24]。雖然蘇云金芽胞桿菌芽胞表面展示系統(tǒng)較其他芽胞表面展示具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但由于其具有致病性，所以蘇云金芽胞桿菌的生物安全性問題仍需考慮。

4 展望

近10年來，由于芽胞獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，芽胞表面展示技術(shù)逐漸受到越來越多的關(guān)注。芽胞獨(dú)特的抗逆性，使芽胞在惡劣環(huán)境中具有抵抗熱、化學(xué)試劑和輻射的能力，同時(shí)枯草芽胞桿菌是公認(rèn)的生物安全菌株，因此枯草芽胞桿菌芽胞在醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

以枯草芽胞桿菌芽胞為載體生產(chǎn)的口服疫苗，克服了傳統(tǒng)可溶性口服疫苗在腸胃中耐受性差、易被降解、吸收有限的缺陷。芽胞良好的抗逆性使疫苗能夠耐受胃液中的酸性環(huán)境，儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)，可順利通過胃腸屏障，快速誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。不僅口服疫苗可誘導(dǎo)機(jī)體正常的免疫應(yīng)答，腹膜注射仍然可以產(chǎn)生免疫應(yīng)答，使枯草芽胞桿菌芽胞在疫苗領(lǐng)域的應(yīng)用極為廣泛。

現(xiàn)在，芽胞表面展示技術(shù)不僅在疫苗領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，在生物催化和細(xì)胞工廠研究領(lǐng)域也越來越受重視。芽胞表面展示技術(shù)作為酶固定化方式的一種，無需純化蛋白，可直接將異源蛋白固定在載體芽胞表面，免去繁瑣的酶純化過程，使生物催化過程更加便捷高效；同時(shí)展示在芽胞表面的蛋白借助芽胞的抗逆性，在惡劣環(huán)境中的穩(wěn)定性也大大增加，為高附加值化合物的工業(yè)生產(chǎn)提供了重要參考。

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Recent progress of the research on spore surface display

Xiaoman Xu1, Xiaochen Wang2, and Cuiqing Ma1

1State Key Laboratory of Microbial Technology,Shandong University,Jinan250100,China
2School of Life Science,Sichuan University,Chengdu610065,China

Received:May 24, 2010;Accepted:July 19, 2010

Supported by:National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2007CB707803).

Corresponding author:Cuiqing Ma. Tel: +86-531-88364003; Fax: +86-531-88369463; E-mail: macq@sdu.edu.cn

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973 計(jì)劃) (No. 2007CB707803) 資助。