白雪，趙晶晶，王倩，童維，張繼遠(yuǎn)，訾金，陳真，劉斯奇，王全會(huì)

中國科學(xué)院北京基因組研究所 蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京 101300

細(xì)胞工廠的代謝網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控

丙酮丁醇梭菌磷酸化蛋白質(zhì)組分析

白雪，趙晶晶，王倩，童維，張繼遠(yuǎn)，訾金，陳真，劉斯奇，王全會(huì)

中國科學(xué)院北京基因組研究所 蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京 101300

近年的研究揭示，細(xì)菌細(xì)胞中蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)可能調(diào)節(jié)信號(hào)或代謝通路的生物活性。丙酮丁醇梭菌是一個(gè)重要的工業(yè)菌株，在酸性條件下能夠生成大量的有機(jī)溶劑。然而，調(diào)節(jié)丙酮丁醇梭菌有機(jī)溶劑生成的分子機(jī)制尚未完全闡明。采用雙向電泳和質(zhì)譜聯(lián)用的技術(shù)，比較了該菌在產(chǎn)酸期與產(chǎn)有機(jī)溶劑期間的差異蛋白質(zhì)譜圖。特別關(guān)注了那些分子量接近但具有不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)。在高有機(jī)溶劑生成速率的丙酮丁醇梭菌中，發(fā)現(xiàn)了 8個(gè)電泳斑點(diǎn)簇呈現(xiàn)明顯的酸移而且伴隨光密度強(qiáng)度的變化。質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)表明，這些蛋白質(zhì)均含有磷酸化修飾的肽段。生物信息學(xué)分析預(yù)示，這些蛋白質(zhì)參與了有機(jī)溶劑的生成過程。但究竟它們的磷酸化狀態(tài)如何調(diào)控有機(jī)溶劑生成仍需更為深入地研究。

丙酮丁醇梭菌，雙向電泳，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)

Abstract:Protein phosphorylation in bacteria is important for signaling and metabolic activity.Clostridium acetobutyicumcan synthesize high yield of organic solvent under acidic condition. How solventogenesis is regulated at molecular level in this bacterium, is not clearly elucidated yet. We used two dimensional electrophoresis (2-DE) and mass spectrometry to have a differential analysis of the bacterial proteins fromClostridium acetobutylicumat acedogenic and solventogenic stage. We focused on these iso-spots with similar molecular mass and different pI values. Totally, eight string spots were identified, which displayed significant changes of pI values as well as spot volumes in response to solventogenic development. The data acquired from mass spectrometry demonstrated that all of the iso-spots contained the phosphrylated peptides. Bioinformatic analysis revealed that these proteins partake in the pathways of solvent synthesis.

Keywords:Clostridium acetobutylicum,2-dementional electrophoresis (2-DE), protein phosphorylation

丙酮丁醇梭菌屬于梭菌屬，因其能夠產(chǎn)生丙酮、丁醇和乙醇而得到了較為廣泛的研究。盡管丙酮丁醇梭菌能夠生產(chǎn)有機(jī)溶劑，但是其生成的效率較低，長期以來在工業(yè)界沒有得到重視。近年來隨著石油資源的大量消耗和人們環(huán)保意識(shí)的逐漸增強(qiáng)，開發(fā)取代石化工業(yè)的技術(shù)和方法得到越來越多的重視。因此，人們正在重新評(píng)估丙酮丁醇梭菌的工業(yè)化的潛在價(jià)值[1]。

一般認(rèn)為，丙酮丁醇梭菌的工業(yè)化前景在于提高該菌的單位有機(jī)溶劑的產(chǎn)量。丙酮丁醇梭菌在對(duì)數(shù)生長期的代謝產(chǎn)物以乙酸、丁酸等有機(jī)酸為主，而當(dāng)進(jìn)入生長穩(wěn)定期，外界pH值下降至4.5左右時(shí)產(chǎn)物主要是丙酮、丁醇和少量乙醇。因此，一種提高有機(jī)溶劑產(chǎn)量的方法是在發(fā)酵過程中對(duì)培養(yǎng)基的酸堿度進(jìn)行適當(dāng)?shù)目刂?。早在上世紀(jì)80年代，有人試圖通過調(diào)整胞外pH提高有機(jī)溶劑產(chǎn)量[2]，或嘗試在中性條件下促進(jìn)有機(jī)溶劑合成[3]。然而，這些努力的效果并不明顯。這樣，采用基因工程技術(shù)改造丙酮丁醇梭菌就成為一個(gè)首要考慮的技術(shù)選擇。目前，關(guān)于該菌的產(chǎn)有機(jī)溶劑的機(jī)理和通路已基本研究清楚，而且丙酮丁醇梭菌的分子操作方法也已成熟。有些科學(xué)家嘗試了在基因組水平上進(jìn)行某些關(guān)鍵基因的突變，并獲得了某些有機(jī)溶劑產(chǎn)量有所提高的菌株，如Spo0A突變菌株等[4]。但是總體而言，基因改造的結(jié)果不盡如人意。究其原因，在于人們對(duì)于丙酮丁醇梭菌中有機(jī)溶劑生成通路的調(diào)控機(jī)制仍不甚了解。如果僅從一兩個(gè)基因的改造著手，無法在整體上改善代謝通路的效率。因此，從全局角度來分析丙酮丁醇梭菌的代謝通路，了解參與通路的各種蛋白質(zhì)的變化，可能是實(shí)現(xiàn)丙酮丁醇梭菌基因改造的前提。

長期以來，細(xì)菌蛋白質(zhì)的磷酸化一直未被充分地認(rèn)識(shí)。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌蛋白質(zhì)的磷酸化也是廣泛存在的，而且在信號(hào)和代謝通路的調(diào)節(jié)中扮演重要角色[5-7]。然而，丙酮丁醇梭菌中蛋白質(zhì)的磷酸化尚未見報(bào)道。我們假設(shè)，該菌的磷酸化狀態(tài)可能在有機(jī)溶劑合成通路中起著某種調(diào)節(jié)功能。在本研究中，我們采用蛋白質(zhì)組學(xué)的手段，對(duì)丙酮丁醇梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC824在產(chǎn)酸期和產(chǎn)溶劑期間的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了比較分析。在這種分析中，我們特別注重分析那些等電點(diǎn)發(fā)生明顯酸移的蛋白質(zhì)，以尋找與有機(jī)溶劑生成相關(guān)的磷酸化蛋白質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 確定丙酮丁醇菌產(chǎn)酸期和產(chǎn)有機(jī)溶劑期

以丙酮丁醇梭菌ATCC824菌株作為研究對(duì)象。采用傳統(tǒng)的梭菌培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，其成分為：K2HPO40.75 g/L，KH2PO40.75 g/L，NaCl 1.0 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，(NH4)2SO42 g/L，MgSO40.4 g/L，蛋白胨2.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，葡萄糖50.0 g/L。在培養(yǎng)過程中，監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基的pH值在不同時(shí)間點(diǎn)上變化，同時(shí)收集培養(yǎng)液進(jìn)行HPLC示差折光檢測(cè)器分析，使用的分析柱為 Aminex HPX-87H (biorad，300 mm×7.8 mm)，是由聚苯乙烯二乙烯苯樹脂填裝而成的有機(jī)酸柱，柱溫15℃，流動(dòng)相為0.05 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min。我們由此判斷培養(yǎng)基中有機(jī)溶劑的產(chǎn)率，從而界定丙酮丁醇菌產(chǎn)酸期和產(chǎn)有機(jī)溶劑期。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)與蛋白提取

采用5 000 ×g、4℃離心15 min的方法分別收集產(chǎn)酸期和產(chǎn)有機(jī)溶劑期的菌體。經(jīng)過3次Tris-HCl洗滌后，將菌體重懸于裂解緩沖液 (15 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS)中，并加入蛋白酶抑制劑 (1 mmol/L PMSF，2 mmol/L EDTA，10 mmol/L DTT) 和磷酸化酶抑制劑 (氟化鈉，原釩酸鈉，焦磷酸鈉，甘油磷酸酯等)，超聲3 min使菌體裂解。將裂解物在4℃、20 000 ×g離心30 min。取上清，并在其中加入10倍體積三氯乙酸冰丙酮溶液后于?20℃放置過夜。所得沉淀即為丙酮丁醇梭菌蛋白質(zhì)。

1.3 雙向電泳及膠圖分析

選取pH范圍為4～7的18 cm膠條 (GE Health)，取200 μg蛋白樣品，在其中加入0.5% DTT和0.2%IPG緩沖液，并用水化緩沖液補(bǔ)充體積至350 μL后上樣。聚焦程序設(shè)置為20℃水化8 h，50 V主動(dòng)水化4 h，500 V快速升壓1 h，1 000 V線性升壓1 h，4 000 V線性升壓1 h，4 000 V聚焦至36 000 VH。經(jīng)過 1% DTT和 2.5% IAM平衡后，進(jìn)行第二維SDS-PAGE電泳。電泳程序設(shè)置為5 W恒功率電泳0.5 h，25 W恒功率電泳至溴酚藍(lán)前沿移動(dòng)到膠面底端。用硝酸銀染色法處理雙向電泳膠。采用 Image Master軟件對(duì)丙酮丁醇梭菌不同生長時(shí)期的雙向電泳膠圖進(jìn)行比對(duì)分析。光密度變化3倍以上的雙向電泳斑點(diǎn)定義為差異蛋白點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定

將差異的電泳斑點(diǎn)切割下來，通過水化、脫水等過程直至膠粒完全變白為止。在 25 mmol/L NH4HCO3(pH 7.0～8.0) 條件下加入0.01 g/L胰蛋白酶，在 37℃保溫過夜。加入終濃度為 0.1%的甲酸終止消化反應(yīng)。在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定中，我們采用100 mm×75 μm C18反向柱 (由本實(shí)驗(yàn)室自制) 與HCTultra (Bruker-Dalton公司) 質(zhì)譜相連。在30 min內(nèi)B液 (B液95%乙腈，0.1%甲酸，A液5%乙腈，0.1%甲酸) 的濃度由2%上升至40%，流速為0.4 μL/min。在一級(jí)質(zhì)譜中信號(hào)最強(qiáng)的3個(gè)離子峰被用于二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)，二級(jí)質(zhì)譜信號(hào)門檻值為3 000。

在肽段鑒定中我們采用Mascot搜索軟件，所選數(shù)據(jù)庫為由 NCBI下載的丙酮丁醇梭菌數(shù)據(jù)庫。一級(jí)質(zhì)譜與二級(jí)質(zhì)譜分質(zhì)量耐受值均設(shè)為 0.5 Da和0.5 Da，烷基化修飾作為固定修飾，甲硫氨酸氧化和絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸磷酸化作為可變修飾。所有搜索到的磷酸化肽段都是基于原始質(zhì)譜峰圖上是否存在中性丟失現(xiàn)象判斷的。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)酸期和產(chǎn)有機(jī)溶劑期的確定

如圖1及圖2所示，在培養(yǎng)7～10 h后，細(xì)菌培養(yǎng)基的OD值約為0.5，pH約為 5.2～5.7之間，細(xì)菌的代謝產(chǎn)物主要以乙酸為主，此階段被認(rèn)定為產(chǎn)酸期；當(dāng)培養(yǎng)16～18 h后，OD值上升至0.6以上，pH下降到4.5以下，產(chǎn)物以丙酮等有機(jī)溶劑為主，此階段被認(rèn)定為產(chǎn)有機(jī)溶劑期。

圖1 丙酮丁醇梭菌生長曲線及對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)基的pH變化Fig.1 The changes of optical intensity and pH values of medium during the cultivation. (A) The optical intensity change curve. (B)The pH value change curve.

圖2 丙酮丁醇梭菌代謝產(chǎn)物的高效液相色譜分析Fig.2 HPLC profiles of the metabolic products ofC. acetobutylicum. (A) The solvent production in acidogenesis ofC.acetobutylicum. (B) The solvent production in solventogenesis ofC. acetobutylicum. Acetic acid and acetone are marked as reporters of different growth stages.

2.2 雙向電泳膠圖分析

丙酮丁醇梭菌全蛋白在雙向電泳膠上得到了很好的分離，圖 3為該菌產(chǎn)酸階段和產(chǎn)有機(jī)溶劑階段蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜。膠圖分析表明，產(chǎn)酸期與產(chǎn)有機(jī)溶劑期的丙酮丁醇梭菌蛋白質(zhì)在電泳斑點(diǎn)的數(shù)量與pI分布上均呈現(xiàn)顯著不同的模式。在產(chǎn)酸期的雙向電泳斑點(diǎn)數(shù)為375個(gè)，其中25個(gè)為產(chǎn)酸階段特有的；產(chǎn)有機(jī)溶劑期雙向電泳斑點(diǎn)數(shù)為 417個(gè)，其中31個(gè)為該階段特有。在這些電泳膠圖中，我們關(guān)注那些成串斑點(diǎn)簇，即分子量相同但等電點(diǎn)不同的相鄰電泳斑點(diǎn)，這提示蛋白質(zhì)可能存在修飾狀態(tài)。

在2個(gè)時(shí)期的成串斑點(diǎn)簇的分布基本相同，共有10個(gè)，其中有2個(gè)斑點(diǎn)簇在產(chǎn)酸和產(chǎn)有機(jī)溶劑階段沒有顯著改變；但是 8個(gè)斑點(diǎn)簇發(fā)生了改變。圖4列舉了其中8個(gè)成串斑點(diǎn)，有 7個(gè)斑點(diǎn)簇在產(chǎn)有機(jī)溶劑期發(fā)生了顯著的斑點(diǎn)酸移且伴有斑點(diǎn)光密度增加；有一個(gè)斑點(diǎn)簇在產(chǎn)酸期發(fā)生了顯著的斑點(diǎn)酸移且伴有斑點(diǎn)光密度增加。

圖3 丙酮丁醇梭菌雙向電泳圖譜Fig.3 2-DE gel image ofClostrdium actobutylicum. (A) The gel image of proteins fromClostrdium actobutylicumin acidogenesis.(B) The gel image ofClostrdium actobutylicumin solventogenesis.

圖4 不同生長階段成串斑點(diǎn)簇膠圖比較Fig.4 Comparison of string spots in 2-DE images ofC.acetobutylicum.Upper panel: the string spots of acidogenesis;lower panel: the string spots of solventogenesis.

2.3 磷酸化蛋白質(zhì)的鑒定

雙向電泳膠圖上的斑點(diǎn)酸移是蛋白質(zhì)可能發(fā)生磷酸化修飾的物理特征，但不是確定的化學(xué)修飾信號(hào)。為了進(jìn)一步確證這些斑點(diǎn)簇是否含有磷酸化蛋白質(zhì)，我們采用質(zhì)譜分析的方法檢測(cè)磷酸化肽段。在肽段的質(zhì)譜圖中，如果一個(gè)肽段有明顯的“中性丟失”現(xiàn)象，即在二級(jí)質(zhì)譜中的某肽段質(zhì)量信號(hào)同時(shí)伴有98或80的質(zhì)量偏移的信號(hào)，而且該肽段含有可被磷酸化的氨基酸基團(tuán)，那么這個(gè)肽段就可能是一個(gè)磷酸化肽段。我們依據(jù)中性丟失這一原則來判斷所選擇的電泳斑點(diǎn)是否發(fā)生了磷酸化修飾。

我們對(duì)上述 10個(gè)成串斑點(diǎn)簇的所有斑點(diǎn)都進(jìn)行了胰蛋白酶消化處理和質(zhì)譜鑒定。如圖5所示，該磷酸化蛋白的二價(jià)母離子峰為 644.31，在二級(jí)質(zhì)譜峰圖中可以清晰地看到其質(zhì)荷比向左偏移至595.3，偏移量為49 (m=98 Da，z=2)，恰好為一個(gè)二價(jià)中性丟失偏移。質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明，9個(gè)斑點(diǎn)簇被鑒定為含有丙酮丁醇梭菌蛋白質(zhì)，而且在同一斑點(diǎn)簇中的所有斑點(diǎn)均為同一蛋白質(zhì)。其中有8個(gè)蛋白質(zhì)含有磷酸化肽段，只有乙酰乙酸脫羧酶所產(chǎn)生的肽段沒有發(fā)現(xiàn)中性丟失現(xiàn)象。我們進(jìn)一步分析這些磷酸化的蛋白質(zhì)在產(chǎn)酸和產(chǎn)有機(jī)溶劑階段的豐度特征，發(fā)現(xiàn) 5個(gè)在產(chǎn)有機(jī)溶劑階段高豐度，1個(gè)在產(chǎn)酸階段高豐度，另外2個(gè)豐度變化不明顯，見表1。

2.4 磷酸化蛋白質(zhì)的功能預(yù)測(cè)

我們采用修飾預(yù)測(cè)、拓?fù)鋵W(xué)、保守區(qū)域、功能聚類等生物信息工具，分析了這 8個(gè)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。發(fā)現(xiàn) 2個(gè)蛋白質(zhì) (Predicted membrane protein和Oligopeptide ABC transporter) 可能定位于細(xì)胞膜；3個(gè)蛋白質(zhì) (Fructose 1,6-bisphosphatase II，Phosphomannomutase，Pyruvate kinase) 可能參與了碳源代謝；有 3個(gè)蛋白質(zhì) (Molecular GroEL，Elongation factor Tu，Oligopeptide ABC transporter)參與了蛋白質(zhì)和多肽代謝。另外，我們所鑒定到的磷酸化位點(diǎn)與預(yù)測(cè)結(jié)果相吻合，進(jìn)一步說明了該實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信性。

圖5 磷酸化蛋白質(zhì)Phosphomannomutase的質(zhì)譜圖譜Fig.5 The mass spectrum of phosphorylated protein Phosphomannomutase. (A) The MS spectrum of peptides eluted at 39.29 min,including the phosphorylated one (highlighted with circle). (B) The MS/MS spectrum of precursor ion 644.31. The sequence of this precursor is AGIVIpTASHNPK, and there is neutral loss of 49.0 between fragment ion of 644.31 and 595.31(highlighted with circle).

表1 丙酮丁醇梭菌中成串斑點(diǎn)簇中鑒定的蛋白質(zhì)及其磷酸化肽段Table 1 Proteins identified from the string spots and the phosphorylated peptides identified by mass spectrometry

3 討論

本研究通過雙向電泳比較和ESI-trap質(zhì)譜鑒定，首次分析了丙酮丁醇梭菌在產(chǎn)酸期與產(chǎn)有機(jī)溶劑期磷酸化蛋白質(zhì)組的變化。以往關(guān)于丙酮丁醇梭菌的報(bào)道雖然很多，但僅僅局限于雙向電泳膠圖中膠點(diǎn)的差異分析，并沒有關(guān)注蛋白質(zhì)的翻譯后修飾現(xiàn)象[8]。而蛋白質(zhì)的翻譯后修飾在細(xì)菌的許多生理代謝過程中發(fā)揮著重要作用。其中，Balodimo等分析發(fā)現(xiàn)丙酮丁醇梭菌中GroEL蛋白質(zhì)的磷酸化修飾現(xiàn)象在熱休克反應(yīng)中有重要作用，可以幫助細(xì)菌適應(yīng)外界溫度的變化[9]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在丙酮丁醇梭菌雙向電泳膠圖中存在若干分子量接近、等電點(diǎn)不同的成串膠點(diǎn)簇，提示這些膠點(diǎn)對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)可能發(fā)生了翻譯后修飾。進(jìn)一步的質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，這些膠點(diǎn)對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)為磷酸化蛋白質(zhì)。在丙酮丁醇梭菌由產(chǎn)酸期到產(chǎn)有機(jī)溶劑期的轉(zhuǎn)化過程中，這些成串膠點(diǎn)簇大部分發(fā)生了酸移及光密度的增加，提示該菌中蛋白質(zhì)磷酸化修飾的狀態(tài)及含量在產(chǎn)有機(jī)溶劑期有明顯增加。

研究表明，在細(xì)菌中的磷酸化修飾大部分發(fā)生在組氨酸和天冬氨酸殘基，而本研究卻僅發(fā)現(xiàn)了發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸位點(diǎn)上的磷酸化修飾。這可能說明丙酮丁醇梭菌中的組氨酸磷酸化修飾程度非常低。目前關(guān)于細(xì)菌磷酸化蛋白質(zhì)的研究結(jié)果多是在大腸桿菌[10]、枯草芽孢桿菌[11]等模式菌中得出的，丙酮丁醇梭菌與這些菌株的同源性較低，并且丙酮丁醇梭菌具有產(chǎn)生大量有機(jī)溶劑的特點(diǎn)，這可能是該菌蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)與其他細(xì)菌有很大不同的部分原因。

對(duì)丙酮丁醇梭菌磷酸化蛋白質(zhì)組的研究，可能為進(jìn)一步調(diào)控其有機(jī)溶劑的產(chǎn)量提供依據(jù)。已經(jīng)有研究表明，細(xì)菌中蛋白質(zhì)的磷酸化修飾參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及產(chǎn)物代謝等過程。本研究在丙酮丁醇梭菌中所發(fā)現(xiàn)的磷酸化蛋白質(zhì)，大部分直接或間接地參與了有機(jī)溶劑的代謝過程。如分子伴侶蛋白 DnaK與 GroEL可能與對(duì)抗較高的有機(jī)溶劑濃度、蛋白質(zhì)相互作用以及熱激反應(yīng)有關(guān)；而Fructose 1,6-bisphosphatase II和Pyruvate kinase直接參與了該菌的中心代謝途徑，其修飾狀態(tài)的變化很可能與有機(jī)溶劑的產(chǎn)量或產(chǎn)酸階段向產(chǎn)有機(jī)溶劑階段的轉(zhuǎn)換有著較為密切的關(guān)系。我們的研究結(jié)果表明蛋白質(zhì)磷酸化修飾水平的變化極有可能參與丙酮丁醇梭菌產(chǎn)有機(jī)溶劑能力的調(diào)控。我們期望通過改變這些蛋白質(zhì)磷酸化修飾程度，從而改變丙酮丁醇梭菌產(chǎn)有機(jī)溶劑的狀態(tài)。此外，本研究對(duì)闡明該菌產(chǎn)有機(jī)溶劑和高濃度溶劑耐受能力的機(jī)制具有重要的參考意義。

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Phosphoproteomic investigation ofClostridium acetobutylicum

Xue Bai, Jingjing Zhao, Qian Wang, Wei Tong, Jiyuan Zhang, Jin Zi, Zhen Chen, Siqi Liu,and Quanhui Wang

Department of Proteomics,Beijing Institute of Genomics,Chinese Academy of Sciences,Beijing101300,China

Received:July 26, 2010;Accepted:September 28, 2010

Supported by:National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2007CB707801), National Natural Science Fundation of China (No.30800023).

Corresponding author:Quanhui Wang. Tel: +86-10-80485327; Fax: +86-10-80485324; E-mail: wangqh@genomics.org.cn

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2007CB707801)，國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (No. 30800023) 資助。