鄒毅輝，李鑫，李峰，薛峰，陳芳，高劍峰

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子832003）

綿羊MHC區(qū)段BAC克隆探針的制備

鄒毅輝，李鑫，李峰，薛峰，陳芳，高劍峰

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子832003）

為了摸索適用于高通量核酸雜交篩選的探針的制備方法，采用GeneQuest軟件分析并選取限制性內(nèi)切酶BseDⅠ酶切 MHC區(qū)段BAC克隆374N21，對(duì)酶切產(chǎn)物32P末端標(biāo)記，并采用 Omega E．Z．N．A DNA Probe Purification Kit純化后放射自顯影檢測(cè)的方法。結(jié)果顯示：酶切結(jié)果與軟件分析一致，純化后探針?lè)植紴?．5～2．0kb，純化回收效率為60%。探針的分布合理，質(zhì)量較高，可滿足高通量雜交篩選的需要。

32P標(biāo)記；綿羊；MHC；放射性自顯影；DNA探針

主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）是被廣泛研究的1個(gè)基因組區(qū)域。MHC的主要作用有：MHC以特殊的方式參與移植反應(yīng)；MHC基因的產(chǎn)物廣泛參與所有哺乳動(dòng)物的免疫反應(yīng)的遺傳控制。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于MHC的遺傳組成，結(jié)構(gòu)與功能的研究已經(jīng)進(jìn)行了大量的工作，并取得了很大的進(jìn)展，但綿羊MHC基因的組成及功能研究報(bào)道較少。我國(guó)是綿羊資源品種豐富的國(guó)家，擁有很多特有的地方品種資源，因此開(kāi)展我國(guó)綿羊的MHC研究，發(fā)現(xiàn)一些抗病基因，在我國(guó)的綿羊抗病育種等領(lǐng)域具有重要的作用。

詹勇華等［1］利用細(xì)菌人工染色體的載體pCC1BAC構(gòu)建了中國(guó)美利奴細(xì)毛羊的基因組BAC文庫(kù)，克隆總數(shù)約19萬(wàn)個(gè)，非重組率為3．2%，平均插入片段大小約為133kb，約7．8倍基因組覆蓋率。并繪制出第一張最詳細(xì)的反芻動(dòng)物MHC區(qū)域的物理圖譜。連續(xù)多次傳代培養(yǎng)文庫(kù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)文庫(kù)克隆的遺傳穩(wěn)定性好［1］，為研究和篩選綿羊 MHC區(qū)段基因提供了良好的平臺(tái)［2］。

噬菌體原位雜交的方法可以成功的從大片段基因組DNA中分離和鑒定出編碼序列，這種方法工作量大，但是較為簡(jiǎn)便和實(shí)用，1次可對(duì)數(shù)百個(gè)kb基因組DNA區(qū)域內(nèi)的表達(dá)序列進(jìn)行篩選［3］。高質(zhì)量的探針制備是雜交篩選成功的最重要的前提條件。本研究通過(guò)對(duì)32P標(biāo)記綿羊MHC區(qū)段BAC克隆探針制備方法的研究，旨在為快速，準(zhǔn)確篩選綿羊MHC區(qū)段基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

中國(guó)美利奴細(xì)毛羊BAC文庫(kù)MHC區(qū)段374N21（編號(hào)表示該克隆位于第374號(hào)文庫(kù)保存平板第N行第21列）BAC克隆。

BseD I限制性內(nèi)切酶訂購(gòu)自Fermentas公司，Omega E．Z．N．A DNA Probe Purification Kit，10 μCi／μL32P訂購(gòu)自北京福瑞公司。

1．2 方法

1．2．1 GeneQuest軟件分析374N21BAC克隆酶切位點(diǎn)

利用GeneQuest軟件分析374N21BAC克隆，選擇酶切后片段分布在2．5kb以下的限制性內(nèi)切酶BseDⅠ。

1．2．2 374N21BAC克隆質(zhì)粒的提取

從－80℃冰箱取出BAC文庫(kù)，在超凈工作臺(tái)中用接種環(huán)沾取374N21BAC克隆菌液，在平板上劃線。37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落到含12．5μg／mL氯霉素液體培養(yǎng)基，37 ℃，180r／min過(guò)夜培養(yǎng)8～12h，采用堿裂解法提取374N21 BAC克隆質(zhì)粒［4］。

1．2．3 綿羊 MHC class I區(qū)段374N21BAC克隆質(zhì)粒的酶切

在55℃反應(yīng)條件下用BseDI酶切374N21 BAC克隆質(zhì)粒4h。取酶切產(chǎn)物10μL瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1．2．432P末端標(biāo)記法標(biāo)記探針

取酶切產(chǎn)物4μL，加入10×Buffer 4．0μL，3×dNTPs（dATP，dGTP，dTTP 2mol／L each）5．0μL，Klenow Fragment（10U／μL）0．2μL，ddH2O 22．8 μL，［a－32P］－dCTP（10μCi／μL）4．0μL。30℃反應(yīng)30 min。70℃加熱5min，終止反應(yīng)，取10μL用1．5%瓊脂糖凝膠電泳。另取1．0μL進(jìn)行盤(pán)分析定量。

1．2．5 探針純化及電泳放射性自顯影檢測(cè)

取20μL的探針?lè)磻?yīng)體系，用 Omega E．Z．N．A DNA Probe Purification Kit純化，60μL ddH2O洗脫，取10μL，用1．0%瓊脂糖凝膠電泳后放射自顯影鑒定探針標(biāo)記及洗脫情況。另取1．0μL進(jìn)行盤(pán)分析定量。

2 結(jié)果與分析

2．1 374N21BAC克隆酶切結(jié)果

限制性內(nèi)切酶BseDⅠ酶切結(jié)果顯示與GeneQuest軟件分析結(jié)果一致（圖1、圖2）。酶切后的片段分布在2kbp以下。

圖1 374N21隆GeneQuest軟件酶切Fig．1Plasmid DNA digestion by GeneQuest software

圖2 374N21克隆BseDI酶切電泳Fig．2Plasmid DNA digestion by BseDI

2．2 探針純化結(jié)果

探針經(jīng)Omega E．Z．N．A DNA Probe Purification Kit純化后凝膠電泳和放射性自顯影結(jié)果（圖3）顯示探針?lè)植荚?．5～2．0kb。其純化效果明顯，有效的去除小片段核酸，且放射性強(qiáng)度能夠滿足雜交后進(jìn)行自顯影以便對(duì)目的片段進(jìn)行定位的要求。

2．3 探針的定量

洗脫前探針濃度為0．1μg／μL，20μL的體系總的探針含量為2．0μg，純化后探針濃度為0．02 μg／μL，純化后探針總量為1．2μg，回收效率為60%（圖4）。

圖3 探針純化結(jié)果Fig．3The probes of purification

圖4 探針盤(pán)分析定量Fig．4Quantitative probes by plate assay

3 討論

動(dòng)物的MHC對(duì)了解動(dòng)物發(fā)病、育種等方面具有很高的價(jià)值。對(duì)人［5］、老鼠［6］、雞［7］、牛［8］和羊［9］的研究表明了MHC與疾病的抗性、易感性和發(fā)病過(guò)程是相聯(lián)系的。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于MHC的遺傳組成，結(jié)構(gòu)與功能的研究已經(jīng)進(jìn)行了大量的工作，并取得了很大的進(jìn)展，但綿羊MHC研究較少，且多數(shù)集中在基因多態(tài)性的研究［10］。我國(guó)的綿羊品種資源豐富，擁有很多特有的地方品種資源，因此開(kāi)展我國(guó)綿羊的MHC研究，發(fā)現(xiàn)一些抗病基因，在我國(guó)的綿羊抗病育種等領(lǐng)域具有重要的作用。

據(jù)文獻(xiàn)［11］報(bào)道，放射性探針的制備包括末端標(biāo)記，缺口平移及隨機(jī)引物等多種方法，而本研究所采用的大片段DNA酶切及末端標(biāo)記雜交探針的方案。與其他方案相比本方案具有易于操作跟蹤和檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，是一種有效篩選特定區(qū)域基因的方法，但是這種方案對(duì)探針的質(zhì)量要求較高。本研究通過(guò)GeneQuest軟件分析選擇合適的限制性內(nèi)切酶，酶切減小雜交探針的長(zhǎng)度，去除小片段核酸的干擾，準(zhǔn)確的定量探針的濃度，制備得到的探針純化后片段大小與預(yù)期值相近且分布合理，探針濃度及放射性標(biāo)記強(qiáng)度均處于可接受范圍內(nèi)?？沙醪脚袛嗬帽狙芯恐蟹椒ㄖ苽涞奶结?lè)线M(jìn)一步研究的要求。目前利用這些探針進(jìn)行的核酸雜交工作正在進(jìn)行中。

［1］詹勇華，陳創(chuàng)夫，高劍峰，等．中國(guó)美利奴細(xì)毛羊BAC文庫(kù)的質(zhì)量評(píng)價(jià)［J］．石河子大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，24（1）：102－104．

［2］Liu H，Liu K，Wang J，et al．A BAC clone－based physical map of ovine major histocompatibility complex［J］．Genomics．2006，88（1）：88－95．

［3］韓力薇，覃文新，趙新泰，等．以PAC和BAC克隆為探針篩選cDNA 文庫(kù)［J］．上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，27（6）：449－452．

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［5］Thomson G．HLA disease associations：models for the study of complex human genetic disorders［J］．Crit Rev Clin Lab Sci，1995，32（2）：183－219．

［6］Walter L，Hurt P，Himmelbauer H，et al．Physical mapping of the major histocompatibility complex class II and class III regions of the rat［J］．Immunogenetics，2002，54（4）：268－275．

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Preparation of Probes Using the MHC Section BAC Cloning of Sheep

ZOU Yihui，LI Xin，Lifeng，XUE Feng，CHEN Fang，GAO Jianfeng
（College of Life Science，Shihezi University，Shihezi 832003，China）

In Order to find a way to manufacture probes that could meet the demand of high throughput hybrid screening，restriction enzymes of BseDⅠdigested the 374N21clone of BAC MHC was analysed by using the Gene Quest software．The production of the digestion labeled with32P，Autoradiography detection after being purified by Omega EZNA DNA Probe Purification Kit．The results showed that digestion results were consistent with the software analysis．Purified probes distribution in 0．5～2．0kb．The efficiency of the purification recovery was 60%．The higher quality of probes can satisfy the needs of hybrid screening．

label with32P；sheep；MHC；probe

S826；Q78

A

2009－06－24

國(guó)家科技部國(guó)際合作重大項(xiàng)目（2006DFB33750）

鄒毅輝（1983－），男，碩士，專(zhuān)業(yè)方向?yàn)閯?dòng)物免疫與育種；e－mail：zyh2319731＠163．com。

高劍峰（1964－），男，教授，博士生導(dǎo)師，從事動(dòng)物免疫與育種研究；e－mail：jianfengg＠shzu．edu．cn。