馮云，任路靜，魏萍，仝倩倩，紀曉俊，黃和

南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院 材料化學工程重點實驗室，南京 210009

微生物發(fā)酵產(chǎn)二十二碳六烯酸代謝機理的研究進展

馮云，任路靜，魏萍，仝倩倩，紀曉俊，黃和

南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院 材料化學工程重點實驗室，南京 210009

二十二碳六烯酸(簡稱 DHA)是一種重要的長鏈多不飽和脂肪酸，對人體具有重要的生理功能。微生物發(fā)酵生產(chǎn)的DHA與魚油來源的DHA相比，具有諸多優(yōu)點，其發(fā)展前景廣闊。以下從發(fā)酵菌株、代謝途徑、關鍵酶以及油脂積累機制等方面進行了綜述，為通過代謝工程等技術手段進一步提高DHA產(chǎn)量提供了參考。

DHA，發(fā)酵，代謝途徑，機理

Abstract:Docosahexenoic acid(DHA)is an important polyunsaturated fatty acid which is beneficial to human health.Compared with the DHA derived from fish oil, DHA by microbial production possesses many advantages, and has a bright prospect.In this article, we reviewed strains, metabolic pathway, key enzymes and mechanism of lipid accumulation for microbial production of DHA.Those information would be greatly helpful for further improving DHA production by metabolic engineering.

Keywords:DHA, fermentation, metabolic pathway, mechanism

多不飽和脂肪酸(PUFAs)是指含有2個或2個以上雙鍵且碳鏈長度為18或18個以上碳原子的直鏈脂肪酸。根據(jù)第一個雙鍵位置的不同，多不飽和脂肪酸可以分為ω-3型、ω-6型和ω-9型。其中，二十二碳六烯酸(Docosahexenoic acid，22:6△4,7,10,13,16,19，簡稱 DHA)俗稱“腦黃金”，屬 ω-3型多不飽和脂肪酸，具有多種重要的生理功能。DHA是人類大腦和視網(wǎng)膜組織中細胞膜的組成成分，對嬰幼兒視覺和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有至關重要的作用；同時它在預防高血壓、動脈硬化、關節(jié)炎以及癌癥等疾病方面具有顯著功效[1]。一些國家的科研機構建議，人們攝入的多不飽和脂肪酸至少應占攝入總脂的3%[2]，應提高膳食中ω-3型多不飽和脂肪酸的比例。因此，DHA被作為功能性因子添加到保健食品和功能食品飲料中。

長期以來，DHA主要來源于深海魚油，但存在諸多缺點，如魚油質(zhì)量會隨著魚的種類、捕撈季節(jié)和地點的不同而不同，含 EPA、易受環(huán)境污染、有魚腥味、純化成本高等。20世紀提出的“單細胞油脂”、“微藻油”是以微生物作為來源發(fā)酵得到的含多不飽和脂肪酸的油脂，已成為當前人們關注的熱點。通過微生物發(fā)酵法制備DHA，與傳統(tǒng)魚油來源相比，具有微生物生長快，易于大規(guī)模培養(yǎng)；多不飽和脂肪酸含量高；不飽和脂肪酸成分單一，不含EPA或EPA含量低，易于分離純化；氧化穩(wěn)定性較好等優(yōu)點，因此微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA可替代魚油來源的DHA，具有廣泛的應用前景。

1 生產(chǎn)DHA的微生物

目前，用于生產(chǎn)DHA的微生物主要是破囊壺菌Thraustochytrium、裂殖壺菌Schizochytrium和隱甲藻Crypthecodinium cohnii，研究情況見表1。

表1 發(fā)酵產(chǎn)DHA微生物研究情況Table 1 Strains for microbial production of DHA

破囊壺菌和裂殖壺菌都是屬于Straminipila界、Heterokonta門、Labyrinthulea 綱、Thraustochytriales目、Thraustochytriales科的異養(yǎng)海洋原生生物[14]，隱甲藻是屬于雙鞭藻類Dinoflagellate的異養(yǎng)海洋生物。其中裂殖壺菌分裂快、發(fā)酵周期短，是商業(yè)化生產(chǎn)DHA理想的生產(chǎn)菌之一。美國Martek公司利用Schizochytrium生產(chǎn)DHA，通過對發(fā)酵過程的優(yōu)化調(diào)控，生物量干重達到170～210 g/L，其中50%是脂質(zhì)，脂質(zhì)中至少50%是DHA，最終DHA的產(chǎn)量高達40 g/L[15]，是至今報道的最高水平。本課題組利用1 500 L發(fā)酵罐，采取分階段溶氧調(diào)控策略，DHA產(chǎn)量達到37.75 g/L，產(chǎn)率為119 mg/(L·h)，在國內(nèi)處于領先水平[7]。

2 DHA合成途徑

目前，提高生產(chǎn)菌合成含DHA油脂的能力主要是通過傳統(tǒng)的生化工程途徑來實現(xiàn)，即通過控制營養(yǎng)條件和環(huán)境條件使代謝流流向脂質(zhì)合成的方向。而隨著現(xiàn)代生物技術的迅速發(fā)展，對生產(chǎn)菌進行遺傳改造為從根本上提高DHA合成能力提供了可能。但遺傳改造的前提是明確這些生產(chǎn)菌中 DHA的合成途徑，因此微生物體內(nèi)DHA合成途徑及其機制一直是研究的熱點和重點內(nèi)容。

2.1 脂肪酸合成酶(FAS)途徑

在細胞質(zhì)中脂肪酸合成酶 FAS(Fatty acid synthase)的作用下，由乙酰-輔酶A和丙二酸單酰-輔酶A經(jīng)過縮合、還原、脫水、還原的循環(huán)，先合成16碳或18碳的飽和脂肪酸，然后在線粒體或微粒體上經(jīng)過一系列延長酶和去飽和酶的交替作用最終合成長鏈多不飽和脂肪酸，如 γ-亞麻酸、花生四烯酸、DHA等(圖1)。

圖1 DHA合成的脂肪酸合成酶途徑[16]Fig.1 Fatty acid synthase pathway for DHA biosynthesis[16].

脂肪酸合成酶是一個由多種酶構成的多酶復合體，包括?；D(zhuǎn)移酶、烯酰ACP還原酶、脫水酶、酮酰ACP還原酶、酮酰ACP合成酶、磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶和?；d體蛋白ACP。不同生物組織內(nèi)該酶的結(jié)構形式略有不同，在動物中，該多酶復合體包含的所有酶定位于一個多肽鏈上；而在真菌中，這些酶分別定位為 2個功能的多肽鏈上。通過氨基酸序列對比發(fā)現(xiàn)，DHA生產(chǎn)菌中的脂肪酸合成酶與真菌中脂肪酸合成酶具有較高的同源性[17]。

此外，該途徑中的延長酶和多種去飽和酶已經(jīng)得到克隆、純化和表達，如高山被孢霉Mortierella alpina中將 γ-亞麻酸(18:3ω-6)轉(zhuǎn)化成雙高亞麻酸(20:3ω-6)的延長酶[18]，魯西毛霉Mucor rouxii中的△ 6 去飽和酶[19]，其中還包括一直備受爭議的△4去飽和酶。為了探究△4去飽和酶是否存在，研究者們采用能夠在體內(nèi)積累 DHA(22:6ω-3)和 DPA(22:5ω-6)的破囊壺菌為研究對象進行了一系列研究，最終證明了△4去飽和酶的存在并闡明了其功能[20-24]。Thraustochytriumsp.的fad4基因編碼△4去飽和酶，將fad4基因與表達載體連接構建出重組表達載體，分別導入釀酒酵母細胞和畢赤酵母進行表達，結(jié)果轉(zhuǎn)化后的細胞可以利用外源添加的底物生成DHA。同時，放射性同位素標記實驗也進一步證實Thraustochytriumsp.中確實存在△4去飽和酶，可以把外源提供的14C標記的 22:5(ω-3)轉(zhuǎn)化成DHA。但是Thraustochytriumsp.中的△4去飽和酶是位于微粒體還是線粒體仍不確定，有待繼續(xù)研究[25]。

2.2 多不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶途徑

Thraustochytriales科的裂殖壺菌不能將外源標記的22:5(ω-3)轉(zhuǎn)化成DHA[21]，因此裂殖壺菌可能不是通過傳統(tǒng)的FAS途徑合成DHA。Metz等[26]對ShewanellaSCRC2738和Schizochytriumsp.的基因組成進行研究，結(jié)果表明，ShewanellaSCRC2738的一段基因上存在5個開放閱讀框，框中至少11個區(qū)域是編碼酶的功能域，其中有8個功能域與PKS合成酶(Polyketide synthase)密切相關，Schizochytriumsp.的基因片段中也存在同樣的結(jié)構域，由此提出Schizochytrium合成 DHA的途徑類似于細菌中的PKS途徑，稱為PUFA合成酶途徑。

圖2 DHA合成的多不飽和脂肪酸合成酶途徑[25]Fig.2 Polyunsaturated fatty acid synthase pathway for DHA biosynthesis[25].KS: β-ketoacyl synthase; KR: β-ketoacyl-ACP reductase; D/I: dehydrase/isomerase; ER: enoyl reducatase.

該途徑中也存在一個類似于脂肪酸合酶的多酶復合體——PKS合成酶，主要存在于海洋細菌和一些能合成多不飽和脂肪酸的真菌中[27]，它包括β-酮酰合成酶、β-酮酰-ACP還原酶、烯酰還原酶、脫水酶/異構酶、?；D(zhuǎn)移酶和酰基載體蛋白。在該多酶復合體作用下，乙酰-輔酶 A和丙二酸-單酰輔酶 A作為基本單位，通過縮合、還原、脫水、還原/異構的循環(huán)，合成DHA(圖2)。與FAS途徑一樣，該途徑也是以?；d體蛋白(ACP)作為延長碳鏈的共價結(jié)合位點。但由于PKS合成酶與FAS合成酶在酶的組成上略有不同，PKS合成酶中存在一個脫水酶/異構酶，因此PKS途徑不存在需氧去飽和引入雙鍵的過程，而是在碳鏈延長過程中直接形成雙鍵。

從表 2中列舉的相關研究可以看出，Schizochytrium中DHA確實是通過PUFA合成酶途徑合成，但是仍有許多問題沒有解決，如裂殖壺菌中DPA(ω-6)是如何形成的；分類地位非常接近的破囊壺菌和裂殖壺菌中DHA合成途徑不相同，而二者的脂肪酸組成卻很相似[16]，因此確切的 DHA合成機制還有待深入研究。

表2 多不飽和脂肪酸合成酶途徑的研究概況Table 2 Studies of polyunsaturated fatty acid synthase pathway

3 DHA油脂積累機制

了解微生物油脂積累機制，特別是DHA合成途徑中的關鍵酶，從而在分子水平上調(diào)控關鍵酶，對于發(fā)酵過程中脂質(zhì)含量和 DHA產(chǎn)量的提高是極其重要的。

3.1 前提條件

乙酰輔酶A是脂肪酸合成的前體物質(zhì)，在細胞質(zhì)中持續(xù)產(chǎn)生乙酰輔酶A是油脂積累的前提條件之一。發(fā)酵過程中為了達到油脂積累的目的，通常將微生物培養(yǎng)在碳氮比高的培養(yǎng)基中，當?shù)春谋M后，微生物可以繼續(xù)吸收碳源，用于脂質(zhì)合成。在產(chǎn)油酵母和部分真菌的培養(yǎng)過程中氮源的減少，可以引起細胞內(nèi)的一系列反應(圖3)[16]，本課題組通過對代謝通量的分析也發(fā)現(xiàn)，氮減少后引起代謝流的遷移，使細胞內(nèi)大量積累的乙酰輔酶A進入脂肪酸的合成[31]。

油脂積累的另一個前提條件是在細胞質(zhì)中產(chǎn)生足夠的NADPH，為脂肪酸合成提供還原力。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，通過在發(fā)酵過程中添加蘋果酸，可以促進 NADPH的生成，產(chǎn)生的總油脂與未添加相比提高了15%，脂肪酸中DHA含量從35%提高到60%[1]。

此外，本課題組利用亞硝基胍(NTG)和紫外照射對Schizochytriumsp.CCTCC M209059進行復合誘變，得到突變株Schizochytriumsp.HX-308M，通過對突變株的酶活分析可以看出，與野生型菌株相比，突變株中產(chǎn)乙酰輔酶A和NADPH的酶活力提高，細胞內(nèi)乙酰輔酶A和NADPH的量顯著增加，脂肪酸中DHA含量高達56.22%，比野生型菌株提高了38.88%[32]。由此可以看出，盡管破囊壺菌和裂殖壺菌中 DHA合成途徑不同，但乙酰輔酶 A和NADPH是油脂有效積累的關鍵因素。

圖3 氮限制引起的生理生化反應Fig.3 Physiological and biochemical responses to nitrogen limitation.

3.2 關鍵酶

檸檬酸裂解酶(ACL，EC 4.1.3.8)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC，EC 6.4.1.2)和蘋果酸酶(ME，EC 1.1.1.40)是啟動脂肪酸合成的3個關鍵酶(圖4)。

ACL催化檸檬酸裂解，反應如下，該酶催化的反應是脂肪酸合成所需乙酰-CoA的來源。

檸檬酸 + CoA + ATP →乙酰-CoA+草酰乙酸+ADP+Pi

ACC催化乙酰-CoA生成丙二酸單酰-CoA，是脂肪酸合成的起始步驟。分離編碼ACC的基因并使其在受體菌中過表達，ACC活性顯著升高并且丙二酸單酰-CoA大量增加，脂肪酸合成速率提高但是含量并沒有顯著增加，說明該酶催化的反應的確是脂肪酸合成的限速步驟，但脂肪酸含量的提高還受其他步驟的制約。

圖4 脂肪酸合成的前體及涉及的關鍵酶Fig.4 Precursors for fatty acid synthesis and key enzymes involved in fatty acid synthesis.MDH: malate dehydrogenase; PDH:pyruvatedehydrogenase; CS: citrate synthase; ICDH: isocitrate dehydrogenase; G6PDH: glucose-6-phosphate dehydrogenase.

蘋果酸酶催化蘋果酸分解生成丙酮酸，同時將NADP+還原成NADPH，為脂肪酸合成提供還原力。有相關研究表明，上面提到的2種酶都與脂質(zhì)的積累程度無關，而蘋果酸酶活性的有無以及活性高低都與細胞內(nèi)脂質(zhì)積累的程度密切相關[33-34]。Song等[35]對蘋果酸酶構型的研究表明，蘋果酸酶的6種異構體中構型Ⅳ與脂質(zhì)積累有關，構型Ⅲ和Ⅳ由同一基因編碼，構型Ⅳ是構型Ⅲ在氮限制(以葡萄糖為碳源)或乙酸為唯一碳源的條件下啟動的后轉(zhuǎn)錄修飾形成的。目前有關研究主要是以產(chǎn) γ-亞麻酸的絲狀真菌——卷枝毛霉為研究對象進行的，日后可以針對裂殖壺菌等產(chǎn) DHA微生物內(nèi)的蘋果酸酶等關鍵酶進行研究，進一步明確它們與脂質(zhì)積累和DHA合成之間的關系，為DHA產(chǎn)量的提高提供理論基礎。

4 研究展望

近年來隨著對 DHA生理及藥用價值的深入研究，其預防心血管疾病、高血壓、抗癌等生理功能也廣泛為人們所接受，DHA的需求量大幅增加，DHA保健品和含DHA的功能食品、飲料等產(chǎn)品具有巨大的市場潛力。因此只有實現(xiàn)DHA的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，提高 DHA產(chǎn)量和質(zhì)量才能滿足人們對DHA的需求。

提高DHA產(chǎn)量一直是微生物發(fā)酵產(chǎn)DHA研究的重點內(nèi)容。現(xiàn)階段的研究主要集中于培養(yǎng)條件和發(fā)酵條件的優(yōu)化，這在一定程度上可以提高DHA的產(chǎn)量，但是效果并不明顯，而代謝工程是從根本上提高DHA產(chǎn)量的重要途徑。以上有關DHA合成途徑、關鍵酶和油脂積累機理的研究是利用現(xiàn)代生物技術手段提高DHA發(fā)酵水平的基礎和前提，今后的研究應該從以下幾個方面展開：

1)繼續(xù)深入研究 DHA合成途徑，從而有針對性地對現(xiàn)有生產(chǎn)菌進行基因改造，選育DHA高產(chǎn)菌株，使其最大量的合成DHA。

2)進一步研究 DHA合成途徑中的關鍵酶，分離并克隆關鍵酶基因，在分子水平對其進行調(diào)控和表達，從而提高DHA產(chǎn)量。

3)考察環(huán)境條件變化對細胞內(nèi)能荷、還原力、關鍵代謝酶系酶活以及油脂積累的影響，從而獲得DHA高效積累策略，提高DHA產(chǎn)率。

4)利用微生物油脂積累機理指導發(fā)酵，優(yōu)化發(fā)酵工藝，從而使代謝流流向所需的目標產(chǎn)物，進一步提高DHA發(fā)酵水平。

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Progress in metabolic mechanism of docosahexenoic acid production by fermentation

Yun Feng, Lujing Ren, Ping Wei, Qianqian Tong, Xiaojun Ji, and He Huang
State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, China

Received:May 9, 2010;Accepted:July 12, 2010

Supported by:Key Program of National Natural Science Foundation of China(No.20936002), National Basic Research and Development Program of China(973 Program)(Nos.2007CB707805, 2009CB724700), the Fifth of Six Projects Sponsoring Talent Summits of Jiangsu Province(No.2008-D-63),College Industrialization Project of Jiangsu Province(No.JH09-30).

Corresponding author:He Huang.Tel: +86-25-83172094; E-mail: biotech@njut.edu.cn國家自然科學基金重點項目(No.20936002)，國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)(Nos.2007CB707805, 2009CB724700)，江蘇省六大人才高峰項目(No.2008-D-63)，江蘇省高?？蒲谐晒a(chǎn)業(yè)化推進項目(No.JH09-30)資助。