申乃坤，張紅巖，王青艷，秦艷，廖思明，王成華，黃日波

1 廣西科學(xué)院 國家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，南寧 530007 2 廣西科學(xué)院生物研究所，南寧 530003

木薯粉與甘蔗汁混合發(fā)酵生產(chǎn)高濃度乙醇

申乃坤1，張紅巖2，王青艷1，秦艷1，廖思明1，王成華1，黃日波1

1 廣西科學(xué)院 國家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，南寧 530007 2 廣西科學(xué)院生物研究所，南寧 530003

對木薯粉和甘蔗汁混合原料進行高溫高濃度乙醇發(fā)酵的條件進行了優(yōu)化，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，先應(yīng)用Plackett-Burman試驗設(shè)計篩選出影響發(fā)酵的重要參數(shù)，再利用正交試驗設(shè)計確定重要因素的最佳水平，即：木薯粉與甘蔗汁的比例為1∶5(W/V)，發(fā)酵初始pH為4.0～4.5，尿素添加量為0.25%(W/W)，硫酸鎂添加量為0.04%(W/W)。最后在發(fā)酵過程中采用梯度溫度控制，可顯著提高發(fā)酵效率。在技術(shù)集成的基礎(chǔ)上，進行了2 L發(fā)酵罐放大實驗，經(jīng)過48 h發(fā)酵，發(fā)酵成熟醪乙醇濃度可達17.84%(V/V)，發(fā)酵效率達91.82%。

木薯粉，甘蔗汁，燃料乙醇，Plackett-Burman設(shè)計，混合發(fā)酵

Abstract:We optimized the conditions of mixed fermentation of very high gravity ethanol with cassava flour and sugarcane juice.Based on the single factor experiment, we screened the important parameters for very high gravity ethanol fermentation with cassava flour and sugarcane juice by the Plackeet-burman design.Then, we obtained the optimum values of the important parameters by the orthogonal experiments: the mixing ratio of cassava flour to sugarcane juice, 1:5; initial pH of fermentation, 4.0?4.5; the concentrations of urea and MgSO4, 0.25% and 0.04%(W/W), respectively.Finally, we used a gradient temperature control strategy with the optimized conditions, and ethanol concentration of 17.84%(V/V)and fermentation efficiency of 91.82% were achieved,correspondingly.

Keywords:cassava flour, sugarcane juice, fuel ethanol, Plackett-Burman design, mixed fermentation

糧食安全決定了發(fā)展生物乙醇應(yīng)遵循“不與人爭糧、不與糧爭地”的原則，因此，非糧作物(木薯、甘蔗、甜高粱等)制取燃料乙醇是國家新能源政策的扶持重點[1]。木薯已被世界公認具有很大發(fā)展?jié)摿Α⒑苡星巴镜囊掖忌a(chǎn)原料，也是我國大力發(fā)展燃料乙醇提倡的非糧作物原料之一。甘蔗是傳統(tǒng)的非糧植物，含糖高，每公頃每年可生產(chǎn)乙醇4 900 L，居各種作物之首，是其他任何作物望塵莫及的[2]。巴西甘蔗乙醇的成功實例也證明了利用甘蔗生產(chǎn)燃料乙醇是可行的[3]。利用甘蔗汁生產(chǎn)燃料乙醇，一方面可以降低燃料乙醇對糧食需求，保障我國的糧食安全；另一方面可以調(diào)節(jié)糖價，保障農(nóng)民權(quán)益，甘蔗燃料乙醇有望成為調(diào)節(jié)食糖供需平衡的杠桿。2009年底，廣西已經(jīng)啟動利用原料甘蔗年產(chǎn)20萬t燃料乙醇的可行性報告，旨在糖價較低時將部分原料甘蔗用于制造燃料乙醇，增加調(diào)控手段。

國內(nèi)外對濃醪發(fā)酵的研究，無論從菌種改造和發(fā)酵工藝優(yōu)化方面都取得了豐碩成果[4-7]。但以淀粉質(zhì)原料進行濃醪發(fā)酵時，存在固形物濃度增大、流動性差的缺點，容易發(fā)生沉淀，不利于大罐連續(xù)發(fā)酵，也不利于蒸餾時醪塔塔釜的再沸器間接加熱，其廢糟由于含有COD濃度太高而不好處理。而以甘蔗汁原料發(fā)酵時，由于含糖量不夠高，發(fā)酵所得乙醇濃度低，蒸餾能耗過大，而且乙醇廢液特別大[8-9]。若采用木薯粉與甘蔗汁原料混合發(fā)酵，以甘蔗汁替代自來水，既提高了甘蔗汁糖液中的總糖濃度，又降低了淀粉質(zhì)原料醪液的固形物濃度，改善流動性，從而有效提高原料的轉(zhuǎn)化速率和利用率，縮短發(fā)酵時間，提高出酒率。

國內(nèi)有關(guān)混合原料發(fā)酵研究較少。易弋等[10]對木薯粉與糖蜜混合發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸進行了研究；陳勇等[11]對木薯粉甘蔗汁混合原料先糖化后發(fā)酵(SHF)工藝進行發(fā)酵；而在高溫條件下(37℃)采用同步糖化發(fā)酵(SSF)的研究還未見報道。本實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上，先應(yīng)用Plackett-Burman試驗設(shè)計篩選出影響混合發(fā)酵的重要參數(shù)，再用正交試驗設(shè)計確定重要因素的最佳水平，同時在發(fā)酵過程中采用溫度梯度控制，進一步降低了殘?zhí)呛?，提高原料利用率?/p>

1 材料與方法

1.1 實驗材料

木薯粉：本地產(chǎn)木薯干片，實驗室粉碎后過40目篩，淀粉含量為71.56%。

甘蔗汁：廣西農(nóng)科院甘蔗研究所提供，錘度為22°Bé，總糖分含量(以還原糖計)為17.36%。

耐高溫菌種：釀酒酵母GXASY-10為本實驗室突變選育后得到的耐高溫高產(chǎn)菌株。

種子培養(yǎng)基(YPD)(g/L)：葡萄糖 20，酵母粉10，蛋白胨20，瓊脂20，蒸餾水1 000 mL，pH值自然(5.9左右)。

斜面培養(yǎng)基(YPED)：YPD培養(yǎng)基加2%瓊脂。

所用酶類：耐高溫淀粉酶Liquozyme Supra，糖化酶 Dextrozyme DX[12]。

1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵流程

根據(jù)前期木薯粉高溫濃醪發(fā)酵的結(jié)果，采用同步糖化發(fā)酵(SSF)[12]，木薯與甘蔗汁以一定比例混合，pH值調(diào)為5.5左右，加入0.15 KNU/g木薯粉的耐高溫α-淀粉酶，迅速加熱到85℃～90℃，液化40 min，降溫到37℃，冷卻調(diào)pH，加入1.21 AGU/g木薯粉的糖化酶，接種發(fā)酵。

1.3 測定方法

還原糖濃度的測定：3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法[13]；總糖濃度的測定：酸水解法[14]，水解后用DNS測還原糖；乙醇濃度的測定：氣相色譜法[15]。

1.4 有關(guān)計算

發(fā)酵效率=實際乙醇產(chǎn)量/理論乙醇產(chǎn)量×100%。

理論乙醇產(chǎn)量(%，V/V)=總糖含量(%，W/V)×乙醇系數(shù)(0.511)/乙醇密度(0.789)。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合原料木薯粉與甘蔗汁的比例對高濃度乙醇發(fā)酵的影響

將木薯粉和甘蔗汁以一定比例混合調(diào)漿后，裝入250 mL三角瓶，裝液量為100 mL，液化后降溫至 37℃接種(10%，V/V)，同時加入糖化酶進行發(fā)酵，搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min，發(fā)酵時間為48 h，測定醪液的殘?zhí)呛鸵掖紳舛?。每個條件設(shè)置 3個平行，試驗結(jié)果數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示。

從圖1可以看出，木薯粉與甘蔗汁比例直接決定著發(fā)酵醪液的總糖濃度和粘度，當(dāng)木薯粉與甘蔗汁比例大于1∶4時，發(fā)酵醪的糖濃度和粘度都很高，糖濃度過高會對酵母菌生長產(chǎn)生抑制，粘度太大會影響菌體的生長狀態(tài)和醪液 CO2的逃逸，從而會使發(fā)酵時間延長，發(fā)酵效率降低，影響原料和發(fā)酵設(shè)備的利用率；當(dāng)木薯粉與甘蔗汁比例小于1∶5時，發(fā)酵醪的糖濃度過低，發(fā)酵結(jié)束后醪液乙醇含量低，增加蒸餾時的能耗和廢水的排放量，從而增加乙醇的生產(chǎn)和后處理成本。綜合考慮到原料的利用率和乙醇后處理的成本，混合原料發(fā)酵的最適比例為1∶5(W/V)，此時混合原料的總糖濃度為29.82%，發(fā)酵醪液的乙醇濃度為 15.63%(V/V)，發(fā)酵效率為80.93%。

圖1 木薯粉與甘蔗汁的比例對乙醇發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of the mixing ratio of cassava flour and sugarcane juice on ethanol fermentation.

2.2 混合原料發(fā)酵初始 pH 值對乙醇發(fā)酵結(jié)果的影響

pH值對混合原料乙醇發(fā)酵的影響主要可分為兩個方面：一方面，pH對酵母菌的生命活動有顯著影響，菌的生長條件、產(chǎn)酶能力及酶活力以及營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞的速度與醪液的 pH值有關(guān)；另一方面，由于發(fā)酵過程采用同步糖化發(fā)酵(SSF)，pH對糖化酶的活性產(chǎn)生影響而影響發(fā)酵結(jié)果。為了探索該混合原料發(fā)酵的最適初始 pH，將木薯粉與甘蔗汁按1∶5(W/V)的比例調(diào)成勻漿，液化降溫至37℃后，分別用硫酸調(diào)節(jié)pH為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，添加糖化酶1.21 AGU/g木薯粉，接種后振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵過程中每4 h測定CO2失重，當(dāng)CO2失重小于0.2 g認為發(fā)酵結(jié)束，測定發(fā)酵醪的殘?zhí)羌耙掖紳舛取?/p>

由圖2可以看出，pH值在4.0～4.5的范圍內(nèi)時，發(fā)酵醪的乙醇相對較高。pH值低于4.0時，發(fā)酵殘?zhí)瞧?，可能與糖化酶活性(最適pH 4.3左右)和菌體的生理狀態(tài)受到抑制；而pH值高于5.0時，主要是糖化酶活性受到影響，而且在工業(yè)生產(chǎn)中過高的pH值會導(dǎo)致雜菌污染。因此，選擇發(fā)酵初始pH值在 4.0～4.5。

圖2 初始pH對乙醇發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of the initial pH value on ethanol fermentation.

2.3 影響混合原料發(fā)酵的重要因素篩選

影響混合原料發(fā)酵的因素很多，Plackeet-Burman設(shè)計非常適合本實驗[16]。根據(jù)單因素實驗及前期研究結(jié)果[12]，以發(fā)酵醪液乙醇體積濃度(%，V/V)的平均值為響應(yīng)值Y，Plackett-Burman實驗設(shè)計矩陣及結(jié)果見表 1，實驗設(shè)計因素及水平見表2，同時借助Design-espert7.1軟件對實驗結(jié)果進行了統(tǒng)計分析，從 T-檢驗結(jié)果可知，發(fā)酵初始 pH值X1、總糖濃度(混合原料比例)X2、尿素X3、硫酸鎂X7這4個因素的可信度分別為高于90%，說明這4個因素是對混合原料乙醇發(fā)酵影響較大的重要因素。需要對較重要的因素進行進一步優(yōu)化。

2.4 各因素正交試驗

通過 P-B實驗得到影響混合原料發(fā)酵較大的 4個因素，通過正交實驗進行混合原料乙醇發(fā)酵優(yōu)化。本實驗設(shè)發(fā)酵初始pH值(A)、發(fā)酵總糖濃度(料水比 B)、尿素添加量(C)、硫酸鎂添加量(D)4個因素，選用L16(45)正交設(shè)計表進行試驗設(shè)計，其中(E)為空列，作為試驗誤差以衡量試驗準(zhǔn)確性。試驗因素水平設(shè)計如表 3所示，結(jié)果見表 4，方差分析結(jié)果見表5。

表1 Plackett-Burman實驗設(shè)計及響應(yīng)值Table 1 Plackett-Burman experiment design and its response

表2 以Plackett-Burman實驗設(shè)計各因素、水平及影響效果Table 2 The factors, levels and results of Plackett-Burman experiment design

表3 正交實驗因子與水平Table 3 The factors and levels of orthogonal experiment

極差分析與方差分析結(jié)果表明，A、B因素達到極顯著水平，C、D 因素達到顯著水平，各因素作用的主次順序為A＞B＞D＞C。即初始pH值＞初始總糖濃度(混合原料的比例)＞硫酸鎂添加量＞尿素添加量。根據(jù)表中數(shù)據(jù)，選擇混合原料高溫高濃度發(fā)酵的最佳條件為A3B3(2)C2D2，即初始pH值為4.0～4.5，初始總糖濃度為30%(木薯粉與甘蔗汁的比例約為 1∶5)，尿素添加量為 0.25%，硫酸鎂添加量為0.04%。此組合在正交表中未出現(xiàn)，為此在最優(yōu)條件下乙醇發(fā)酵(250 mL三角瓶，裝液量為100 mL)驗證試驗，實驗結(jié)果(取5個平行的平均值)如下：發(fā)酵時間 48 h，成熟醪乙醇濃度為 17.14%(V/V)，殘還原糖 0.62%(W/V)，殘總糖 1.87%(W/V)，淀粉利用率為88.56%，確定該組合為最優(yōu)組合。

表4 正交試驗結(jié)果Table 4 The results of orthogonal experiment

2.5 發(fā)酵過程溫度控制對殘?zhí)呛鸵掖紳舛扔绊?/h3>

從驗證試驗結(jié)果看：發(fā)酵結(jié)束后殘總糖偏高，原料利用率偏低，影響混合原料乙醇發(fā)酵的產(chǎn)業(yè)化前景。許宏賢等[17]采用降溫控制可實現(xiàn)增加乙醇濃度，降低殘?zhí)堑哪康?。為了進一步降低混合原料的發(fā)酵殘?zhí)嵌O(shè)置了梯度降溫試驗，降溫方式見表6，發(fā)酵結(jié)果見表7。

表5 正交實驗方差分析結(jié)果Table 5 Analysis of variance of orthogonal design of experiment

表6 發(fā)酵溫度不同方式梯度控制Table 6 Different fermentation temperature staging ways

表7 溫度變化對發(fā)酵結(jié)果的影響Table 7 Effect of the temperature on ethanol fermentation

從表7可以看出，與方式1相比，方式2的發(fā)酵結(jié)果較差，可能于12 h開始降溫，降溫太早會影響糖化酶活性，使糖化過程較長，從而使發(fā)酵時間延長；方式4采用36 h降溫，此時在高溫和高濃度乙醇下，酵母的活性很低，再降低溫度對發(fā)酵的影響不是很大；而方式3采用24 h降溫則可大幅度降低殘?zhí)牵蚩赡苁遣扇∵m當(dāng)?shù)臏囟忍荻瓤刂撇呗?，使酵母細胞的活力得以長久維持，增強了酵母生產(chǎn)乙醇的能力和對乙醇的耐受性。由此可見，發(fā)酵溫度越高前期乙醇的生產(chǎn)速率越高，但酵母衰老也越早，乙醇的產(chǎn)物抑制也越嚴重；低溫發(fā)酵雖然非常有利于發(fā)酵后期乙醇的生產(chǎn)，但前期產(chǎn)酒較慢，發(fā)酵周期偏長[17]。有關(guān)溫度梯度控制的最優(yōu)方式及機理還有待進一步研究。

2.6 2 L發(fā)酵罐放大實驗

利用優(yōu)化的最優(yōu)條件，進行3次2 L發(fā)酵罐發(fā)酵試驗，結(jié)果取平均值，如圖3所示，經(jīng)過48 h發(fā)酵，發(fā)酵成熟醪乙醇濃度可達17.76%(V/V)，發(fā)酵效率達91.80%，為進一步放大實驗打下堅實基礎(chǔ)。

圖3 2 L發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果Fig.3 Fermentation result of 2 L fermentor.

3 結(jié)論

本實驗對木薯粉和甘蔗汁混合原料進行高溫高濃度乙醇發(fā)酵的條件進行了優(yōu)化，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，先應(yīng)用Plackett-Burman試驗設(shè)計篩選出影響發(fā)酵的重要參數(shù)，再利用正交試驗設(shè)計確定重要因素的最佳水平，即：木薯粉與甘蔗汁的比例為1∶5，發(fā)酵初始 pH 為 4.0～4.5，尿素添加量為 0.25%(W/W)，硫酸鎂添加量為0.04%(W/W)。最后在發(fā)酵過程中采用梯度溫度控制，可顯著提高發(fā)酵效率。在技術(shù)集成的基礎(chǔ)上，進行了2 L發(fā)酵罐放大實驗，經(jīng)過48 h發(fā)酵，發(fā)酵成熟醪乙醇濃度可達17.84%(V/V)，發(fā)酵效率達91.82%。表明采用混合原料發(fā)酵，既提高了甘蔗汁糖液中的總糖濃度，又降低了淀粉質(zhì)原料醪液的固形物濃度，改善流動性，從而有效提高原料的轉(zhuǎn)化速率和利用率，縮短發(fā)酵時間，提高出酒率。木薯粉和甘蔗汁混合原料發(fā)酵符合我國發(fā)展非糧燃料乙醇的原則，尤其適合同時具有豐富木薯和甘蔗資源的地區(qū)(如廣西、廣東、海南等)大力推廣。

REFERENCES

[1]Yi Y, Li Y, Wu SH,et al.Optimization of high-gravity fermentation conditions for ethanol production from cassava.Chin Brew, 2008, 23: 61?65.易弋, 黎婭, 伍時華, 等.木薯粉酒精濃醪發(fā)酵條件的優(yōu)化.中國釀造, 2008, 23: 61?65.

[2]Li MM, Yu SJ.Present status & the prospect of fuel ethanol production by sugar cane.Liquo Making, 2007, 6:111?113.李苗苗, 于淑娟.甘蔗生產(chǎn)燃料乙醇的發(fā)展現(xiàn)狀及前景展望.釀酒科技, 2007, 6: 111?113.

[3]Uppal SK, Thind KS, Gill RS.Feasibility of ethanol production from cultivated sugarcane varieties of punjab.Sugar Tech, 2006, 8(2&3): 180?183.

[4]Wang S, Thomas KC, Sosulski K,et al.Grain pearling and very high gravity(VHG)fermentation technologies for fuel alcohol production from rye and triticale.Process Biochem, 1998, 34: 421?428.

[5]Rasmus D, Sven P, Lisbeth O.Characterization of very high gravity ethanol fermentation of corn mash.Effect of glucoamylase dosage, pre-saccharification and yeast strain.Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 68: 622?629.

[6]Xue YM, Jiang N.Study on ethanol tolerance ofSaccharomyces cerevisiaeX330 under very high gravity medium.Chin J Biotech, 2006, 22(3): 508?513.薛穎敏, 江寧.釀酒酵母 X330高濃度發(fā)酵時耐酒精性能的初步研究.生物工程學(xué)報, 2006, 22(3): 508?513.

[7]Huang YT, Wu SL, Du LX.The optimization for alcohol very gravity fermentation from corn meshing.Sci Technol Food Ind, 2002, 23(8): 66?69.黃宇彤, 伍松陵, 杜連祥.玉米酒精超高濃度發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化.食品工業(yè)科技, 2002, 23(8): 66?69.

[8]Savitree L, Chutima S, Wichien Y.Production of fuel ethanol at high temperature from sugar cane juice by anewly isolatedKluyveromyces marxianus.Bioresour Technol, 2007, 98(17): 3367?3374.

[9]óscar JS, Carlos AC.Trends in biotechnological production of fuel ethanol from different feedstocks.Bioresour Technol, 2007, 99(13): 5270?5295.

[10]Yi Y, Wu SH, Jiang CD,et al.Study on mixed fermentation of citric acid with manioc flour and sugarcane molasses.Food Sci, 2007, 28(10): 395?397.易弋, 伍時華, 蔣常德, 等.木薯粉與糖蜜混合發(fā)酵檸檬酸的研究.食品科學(xué), 2007, 28(10): 395?397.

[11]Chen Y, Tang ZX, Yu WJ,et al.Process on ethanol production from mixed material Optimization: CN,200610035452.20071114.陳勇, 唐兆興, 余偉俊, 等.酒精生產(chǎn)的混合原料發(fā)酵工藝: CN, 200610035452.20071114.

[12]Shen NK, Wang QY, Huang RB,et al.Enhancing ethanol production by using thermophilic yeast by response surface methodology.Chin J Biotech, 2010, 26(1): 42?47.申乃坤, 王青艷, 黃日波, 等.響應(yīng)面法優(yōu)化耐高溫酵母生產(chǎn)高濃度乙醇.生物工程學(xué)報, 2010, 26(1): 42?47.

[13]Rasmus D, Sven P, Lisbeth O.Characterization of very high gravity ethanol fermentation of corn mash.Effect of glucoamylase dosage, pre-saccharification and yeast strain.Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 68: 622?629.

[14]Wang LS, Ge XY, Zhang WG.Improvement of ethanol yield from raw corn flour byRhizopussp.World J Microbiol Biotechnol, 2007, 23: 461?465.

[15]Tao F, Miao JY, Shi GY,et al.Ethanol fermentation by an acid-tolerantZymomonas mobilisunder non-sterilized condition.Process Biochem, 2005, 40: 183?187.

[16]Hacker RL, Burman JP.The design of optimum multifactorial experiments.Biometrika, 1946, 33:305?325.

[17]Xu HX, Duan G.Effect of temperature on the no cook,very high gravity ethanol fermentation processChin J Biotech, 2010, 26(3): 330?334.許宏賢, 段鋼.溫度對超高濃度酒精生料發(fā)酵體系的影響.生物工程學(xué)報, 2010, 26(3): 330?334.

Very high gravity ethanol fermentation with cassava flour and sugarcane juice

Naikun Shen1, Hongyan Zhang2, Qingyan Wang1, Yan Qin1, Siming Liao1, Chenghua Wang1,and Ribo Huang1
1 National Engineering Research Center for Non-food Biorefinery, Guangxi Academy of Sciences, Nanning 530007, China 2 Biology Institute, Guangxi Academy of Sciences, Nanning 530003, China

Received:April 12, 2010;Accepted:July 23, 2010

Supported by:National Key Technology Research and Development Program(No.BAD75B05), Science and Research foundation of Guangxi Academy(No.10YJ25SW07).

Corresponding author:Ribo Huang.E-mail: rbhuang@gxas.cn國家科技支撐計劃(No.BAD75B05)，桂科院基金(No.10YJ25SW07)資助。