鄒繼紅，娜日蘇，楊慧明，劉青妍

（赤峰學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

反相高效液相色譜法測定獨活中蛇床子素與異歐前胡素的含量

鄒繼紅，娜日蘇，楊慧明，劉青妍

（赤峰學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

目的：建立測定獨活中蛇床子素和異歐前胡素的高效液相色譜法.方法：采用Zorbax C18柱，乙腈-0.1%三乙胺水溶液（75:25）為流動相，流速為1mL·min-1，檢測波長308 nm.結(jié)果：蛇床子素的線性范圍為25.6～186.8mg·L-1，回歸方程為Y＝4.352×104X+1.062×102，r＝0.9998，平均加樣回收率為 98.2%，RSD=1.02%；異歐前胡素的線性范圍為1.66～20.4mg·mL-1，回歸方程為Y=5.736×102X+1.122，r=0.9999，平均加樣回收率為98.8%，RSD=1.04%.結(jié)論：該方法簡便、快速、準(zhǔn)確，適用于獨活中蛇床子素和異歐前胡素的質(zhì)量控制.

反相高效液相色譜法；獨活；蛇床子素；異歐前胡素；含量測定

獨活為傘形科植物重齒當(dāng)歸的干燥根.性味辛、苦，微溫.歸腎、膀胱經(jīng).具有祛風(fēng)，除濕，散寒，止痛之功效，是治療風(fēng)寒濕痹，腰膝酸痛，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，風(fēng)寒頭痛等癥的傳統(tǒng)用藥.獨活中含有大量的蛇床子素和少量的異歐前胡素，本實驗采用反相高效液相色譜法同時測定不同產(chǎn)地獨活中的蛇床子素和異歐前胡素含量，通過比較不同產(chǎn)地獨活的質(zhì)量，為合理利用該藥用植物資源及評價不同產(chǎn)地獨活的質(zhì)量提供依據(jù).

1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀（配置安捷倫色譜工作站），KQ-250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），METTLER AE240電子天平（瑞士梅特勒公司），TG332A型微量分析天平（上海儀器有限公司），PE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），HH-2型恒溫水浴鍋（金壇市新航儀器廠），SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵（河南太康教材儀器廠）.

蛇床子素對照品和異歐前胡素對照品均購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇為色譜純(天津市康科德科技有限公司)，實驗用水為娃哈哈純凈水，冰醋酸、乙醚、乙酸乙酯和乙醇均為分析純.

獨活藥材分別購自各地藥材公司.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱溫室溫.流動相：乙腈-0.1%三乙胺水溶液（75:25），流速 1.0mL·min-1；檢測波長 308nm，進(jìn)樣量20μL.

2.2 試驗溶液的制備

2.2.1 蛇床子素對照品溶液

精密稱取蛇床子素對照品10mg，置25ml容量瓶中，用甲醇溶解，并稀釋至刻度，即得400mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液.

2.2.2 異歐前胡素對照品溶液

精密稱取異歐前胡素對照品3mg，置50ml容量瓶中，用甲醇溶解，并稀釋至刻度，即得60mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液.

2.2.3 混合對照品溶液

分別精密吸取5.0ml蛇床子素對照品溶液和異歐前胡素對照品溶液，置25ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得混合對照品溶液.

2.2.4 樣品溶液的制備

稱取獨活藥材粉末約1.0g，精密稱定，加6倍量體積的甲醇40℃水浴下提取2次，每次2h，合并提取液，減壓回收溶劑，殘渣用甲醇超聲溶解轉(zhuǎn)移至50mL的量瓶中，并定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，即得.

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗

理論塔板數(shù)以蛇床子素和異歐前胡素計算均不低于24000，兩物質(zhì)的色譜峰之間及與相鄰峰之間分離度均大于1.5，對稱因子均在0.95~1.05之間.將對照品溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣20μL，記錄色譜圖，對照品及樣品色譜圖見圖1.

圖1 高效液相色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密吸取蛇床子素對照品溶液0.75，1.0，1.5，3.0，4.5mL置于 10mL量瓶中，以甲醇稀至刻度，各取20μL進(jìn)樣，以蛇床子素峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以蛇床子素濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為 Y＝4.352×104X+1.062×102，r＝0.9998.結(jié)果表明，蛇床子素的濃度在25.6～186.8mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

分別精密吸取異歐前胡素對照品溶液0.25，0.5，1.0，2.0，3.0mL置于 10mL量瓶中，以甲醇稀至刻度，各取20μL進(jìn)樣，以異歐前胡素峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以異歐前胡素濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=5.736×102X+1.122，r=0.9999.結(jié)果表明，異歐前胡素的濃度在1.66～20.4mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.4 精密度試驗

取1號藥材樣品粉末1.0g，精密稱定，按樣品溶液的制備方法制備成供試品溶液，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，計算蛇床子素和異歐前胡素峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.92%和1.14%.

2.5 穩(wěn)定性試驗

取12號藥材樣品粉末1.0g，精密稱定，按樣品溶液的制備方法制備成供試品溶液，放置0，2，4，8，12，24h后，按上述色譜條件分別進(jìn)樣測定.結(jié)果表明，供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，蛇床子素和異歐前胡素峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.88%和0.97%.

2.6 重復(fù)性試驗

取9號藥材樣品粉末6份，每份1.0g，精密稱定，按樣品溶液的制備方法制備成供試品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣，測得蛇床子素和異歐前胡素含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.28%和1.87%.

2.7 回收率試驗

精密吸取已知含量獨活藥材(9號藥材樣品)粉末0.5g，分別加入一定量的蛇床子素和異歐前胡素對照品溶液，按供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，按上述色譜條件分別測定.蛇床子素和異歐前胡素的回收率分別為98.2%和98.8%，RSD值分別為1.02%和1.04%.測定結(jié)果見表1～2.

表1 蛇床子素回收率測定結(jié)果

表2 異歐前胡素回收率測定結(jié)果

2.8 樣品的測定

稱取各編號下獨活藥材粉末約1.0g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣測定.測定結(jié)果見表3.

3 討論

3.1 以分光光度計掃描蛇床子素和異歐前胡素對照品溶液，結(jié)果蛇床子素的的最大吸收波長為321nm，異歐前胡素的最大吸收波長為308nm，但獨活中蛇床子素的含量較異歐前胡素大得多，為使異歐前胡素的測定靈敏度合乎要求，所以選擇在308nm處測定.

表3 樣品測定結(jié)果

3.2 在流動相選擇的過程中，曾經(jīng)嘗試用乙腈-水和甲醇-水作為流動相，但蛇床子素和異歐前胡素的峰形不佳，故加入三乙胺進(jìn)行調(diào)節(jié)，因此采用流動相為乙腈-0.1%三乙胺的水溶液=75:25，在此條件下，蛇床子素和異歐前胡素峰形對稱，且能與其他組分得到良好分離.

3.3 曾經(jīng)使用Kromasil C18柱測定，但組分保留時間太短，與前面的組分分不開，后改用Zorbax C18柱，保留時間適中，且能與其他組分得到良好分離.

3.4 樣品的預(yù)處理，曾經(jīng)采用甲醇、乙醇、乙酸乙酯和乙醚等溶劑分別進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇回流提取所得異歐前胡素的含量最高，乙醇回流提取時所得蛇床子素含量最高，但獨活藥材中蛇床子素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于異歐前胡素，故本文選擇以甲醇提取.

3.5 實驗結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地的獨活藥材中蛇床子素和異歐前胡素含量差異顯著.蛇床子素含量最高的為山西太原產(chǎn)獨活，與其含量最低的湖北武昌產(chǎn)獨活中蛇床子素的量相差四倍多；河南產(chǎn)獨活中異歐前胡素含量卻為這13個產(chǎn)地中最低的，與其含量最高的甘肅蘭州產(chǎn)獨活中的異歐前胡素含量相差更為懸殊，接近9倍.說明不同地域的氣候、土壤等條件，可能極大的影響?yīng)毣钪懈鞣N化學(xué)成分的含量.

〔1〕賈敏如,王夢月,金曲嫫，等.HPLC 測定 13種白芷中歐前胡素和異歐前胡素的含量[J].華西藥學(xué)雜志，2003,18(5):361-362.

〔2〕吳承云,郭力,董曉萍.HPLC測定寄生追風(fēng)液中獨活的有效成分蛇床子素 [J].華西藥學(xué)雜志，2000,15(2):129-130.

〔3〕徐以亮,徐海波,李松.HPLC測定獨活藥材及配方顆粒中蛇床子素的含量 [J].中成藥，2005，27(1)：105-106.

〔4〕王洪志,李惠芬，周靜，等.HPLC法測定元胡止痛片中歐前胡素和異歐前胡素 [J].中草藥，2007，38（7）：1018-1019.

〔5〕劉曉華，孫文基，李濤.HPLC法測定獨活中蛇床子素的含量[J].藥物分析雜志，2004，24（2）：212-213.

〔6〕張娜,李云霞,孟憲生，等.高效液相色譜法測定羌活藥材中異歐前胡素含量[J].遼寧中醫(yī)雜志，2006，33（7）：870-871.

〔7〕王書妍,谷學(xué)新,侯士果，等.HPLC 測定頭風(fēng)痛膠囊中歐前胡素和異歐前胡素的含量[J].藥物分析雜志，2006，26（7）：1011-1013.

〔8〕石鉞，王衛(wèi)華,杜力軍.高效液相色譜法測定感冒一小時膠囊中異歐前胡素和蛇床子素的含量[J].中國中藥雜志，2004，29（10）：950-952.

R927.2

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1673-260X（2010）02-0063-03