張燁，于在江，辛麗，陳永坤，唐啟慧，陳禹保，陳清軒，舒躍龍

1 中國疾病預防控制中心病毒病所 國家流感中心，北京 100052 2 北京標凱科技有限公司，北京 100094 3 北京中亞國瑞生物經(jīng)濟研究所，北京 102206

流感病毒H1N1血凝素基因和神經(jīng)氨酸酶基因在酵母菌中的表達

張燁1，于在江1，辛麗1，陳永坤1，唐啟慧2，陳禹保3，陳清軒2，舒躍龍1

1 中國疾病預防控制中心病毒病所 國家流感中心，北京 100052 2 北京標凱科技有限公司，北京 100094 3 北京中亞國瑞生物經(jīng)濟研究所，北京 102206

在成功克隆流感病毒H1N1全長HA(Hemagglulinin，HA)、NA(Neuramidinase，NA)基因并測序的基礎上，將部分基因序列克隆到表達載體pMETA上，構建了重組表達質粒pMETA/HA(52～1 557 bp)、pMETA/NA(121～1 263 bp)，電轉化真核酵母菌pMAD16，甲醇誘導表達，利用Ni2+親和層析柱對重組蛋白進行純化，并用Western blotting和ELISA方法檢測其抗原性。SDS-PAGE顯示重組蛋白在酵母菌中可以高效表達，蛋白純度占總蛋白的 95%以上，ELISA和Western blotting實驗證實，重組蛋白具有良好的抗原性。成功克隆和表達了流感病毒H1N1 HA、NA基因序列，為流感病毒H1N1診斷試劑和疫苗的開發(fā)等進一步的研究提供了參考。

流感病毒H1N1，血凝素，神經(jīng)氨酸酶，酵母表達

Abstract:On the basis of successful cloning the full length hemagglulinin(HA)and neuramidinase(NA)gene and sequence analysis of influenza virus H1N1, part of the gene was ligated into pMETA.Expression vectors pMETA/HA(52–1 557 bp)and pMETA/NA(121–1 263 bp)were constructed and expressed in pMAD16 induced by methanol.Recombinant protein was purified through Ni2+affinity chromatography.Western blotting and ELISA were used to determine the antigenic activity of the recombinant protein.SDS-PAGE showed that the recombinant capsid gene could be overexpressed inPichia methanolica.ELISA and Western blotting showed that the recombinant protein had antigenicity.

Keywords:influenza virus H1N1, hemagglutinin, neuramidinase, yeast express

A型流感病毒H1N1亞型也稱H1N1病毒，是A型流感病毒的一種，也是人類最常感染的流感病毒之一。一些 H1N1的種類可以在人類間傳播，包括1918 年的流感大爆發(fā)，另一些可在雀鳥和豬 隻 間傳播。H1N1亞型流感病毒不僅能導致上呼吸道和肺部的感染，同時還能導致腦部、心臟、胰腺等全身性多器官的感染。流感病毒點突變造成的抗原漂移可導致流感每年季節(jié)性流行，而基因重配造成的抗原轉換則可能產(chǎn)生新的亞型，因人類對新亞型普遍缺乏免疫力而可能導致流感世界大流行[1-4]。

導致 2009年流感大流行的病毒為新型甲型H1N1病毒，是由豬流感病毒演變而來，主要通過呼吸道引起人與人之間的傳播。其癥狀與季節(jié)性流感相似，其病毒基因組包含有禽流感、豬流感和人流感3種流感病毒的核糖核酸基因片段[5-7]。流感病毒正是通過不斷改變其抗原性來逃避宿主特異性免疫的識別，從而不斷引起流行，尤其以HAl區(qū)的抗原決定簇位點的變異最為重要[8]，因此，有關流感病毒 H1N1生物學特性、致病機理、診斷和預防的研究日益受到衛(wèi)生防疫人員的重視。

血凝素(Hemagglulinin，HA)蛋白是病毒表面的主要糖蛋白之一，屬于主要的保護性抗原，它不僅可以誘導特異性中和抗體產(chǎn)生，而且還可以刺激機體產(chǎn)生細胞毒性淋巴細胞(CTL)反應。另外，HA在病毒吸附、穿膜以及決定病毒的宿主特異性和致病力方面均發(fā)揮關鍵作用[9]。NA基因編碼的神經(jīng)氨酸酶(Neuramidinase，NA)蛋白是體液免疫的靶抗原，可誘導機體產(chǎn)生特異性抗體，抗體具有免疫保護作用[10]。

本研究利用真核酵母菌表達系統(tǒng)成功表達了H1N1病毒HA、NA蛋白，并對重組蛋白抗原性進行了初步評價，為血清流行病學調查及診斷試劑的開發(fā)打下了良好的基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

流感病毒 H1N1由中國疾病預防控制中心病毒病所國家流感中心分離培養(yǎng)；大腸桿菌E.coliDH5α、DNA marker為北京標凱科技有限公司產(chǎn)品；pMETA載體為Invitrogen公司產(chǎn)品；pMD20-T載體、蛋白marker為TaKaRa公司產(chǎn)品；限制性內切酶、T4 DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品；DNA 聚合酶、逆轉錄酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒、質粒DNA小量抽提試劑盒、RNA抽提試劑盒為北京標凱科技有限公司產(chǎn)品；Ni-NTAgrose為Qiagen公司產(chǎn)品；其他試劑為分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 流感病毒H1N1(安徽分離株)全基因組提取以及HA、NA基因的克隆

病毒基因組的提取按病毒 RNA提取試劑盒說明書進行操作。根據(jù) GenBank中流感病 H1N1(GenBank Accession No.EU516079.1)基因序列，設計出針對H1N1 HA和NA大片段的引物。以提取的病毒 RNA為模板，在逆轉錄酶的作用下逆轉錄HA和NA基因。操作步驟為：模板與引物70℃保溫10 min后迅速在冰上急冷3 min，瞬離再加入已混合好的緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、反轉錄酶、無 RNA酶水，42℃保溫 1 h。以逆轉錄出的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，反應條件為：95℃預變性5 min；93℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR結束后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性的片段，用膠回收試劑盒回收純化后，克隆至pMD20-T載體，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞 DH5α，PCR鑒定，陽性質粒送北京標凱科技有限公司測序鑒定。引物序列見表1。

1.2.2 HA、NA蛋白抗原片段表達質粒的構建

根據(jù)HA、NA蛋白基因陽性重組質粒的測序結果設計引物(表 1)。以流感病毒 H1N1蛋白基因陽性重組質粒(pMD20-T-HA/NA)為模板進行PCR，反應條件為：95℃預變性5 min；93℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴增出尾部截短150 bp的兩端帶有酶切位點和保護堿基的HA和NA基因序列。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收純化后雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的pMETA載體連接，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞 DH5α，挑單克隆擴大培養(yǎng)，PCR鑒定出陽性克隆。重組質粒pMETA/HA(52～1 557 bp)、pMETA/NA(121～1 263 bp)PCR陽性克隆送北京標凱科技有限公司測序。

表1 文中所用的引物序列Table 1 The primer sequences in this study

1.2.3 HA、NA蛋白抗原片段的表達

pMETA/HA(52～1 557 bp)、pMETA/NA(121～1 263 bp)陽性質粒經(jīng)AscI線性化，電轉化P.methanolicapMAD16，涂MD平板，挑單克隆，接種入10 mL BMDY培養(yǎng)基中，30℃、250 r/min振搖過夜。次日將10 mL培養(yǎng)物離心收集菌體，懸浮于100 mL BMMY培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)3 d，每天補充甲醇至終濃度0.5%，3 d后離心收集菌體，并用PBS洗1次，?40℃凍融2次，用1/10體積的PBST(PBS，0.5%Triton-X100，pH 7.4)懸浮菌體，加 PMSF至終濃度為1 mmol/L，玻璃珠渦旋振蕩破碎菌體，4℃、12 000 r/min離心30 min，分別收集沉淀和上清，沉淀再次溶于8 mol/L尿素中，4℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清，棄沉淀，SDS-PAGE檢測目的蛋白表達情況，結果顯示蛋白獲得了高效表達，分子量大小比預期的大，推測是蛋白經(jīng)過了糖基化修飾，可溶性分析證明蛋白既有可溶性表達也有包涵體表達。

1.2.4 表達產(chǎn)物的純化

用Ni-NTA agarose按QAGEN手冊方法純化上清(可溶性表達)，PBS透析。

1.2.5 純化產(chǎn)物抗原性的鑒定

ELISA檢測：以梯度稀釋的表達重組蛋白抗原包被，梯度稀釋的兔抗流感病毒 H1N1血清作為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，進行ELISA檢測，并設空白對照和免疫前小鼠血清為陰性對照，待測樣本OD值大于陰性對照OD值2倍以上為陽性。

Western blotting檢測：以重組蛋白為抗原，兔抗流感病毒H1N1血清作為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，進行Western印跡檢測，并設誘導的pMAD16(轉入pMETA空質粒)為陰性對照。

2 結果

2.1 H1N1病毒全基因組提取以及HA、NA基因的克隆

病毒RNA模板經(jīng)逆轉錄及PCR擴增后，瓊脂糖電泳顯示得到一條1 700 bp和一條1 400 bp左右的條帶(圖1)，此條帶與T載體連接轉化后得到多個陽性克隆，測序結果分析，這 2條基因序列是H1N1病毒的血凝素和神經(jīng)氨酸酶基因。

圖1 HA、NA基因的PCR擴增Fig.1 PCR analysis for HA and NA.M: DNA marker; 1: PCR products of HA gene; 2: PCR products of NA gene.

2.2 HA、NA蛋白抗原片段表達質粒的構建

PCR產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收純化后，上下游酶切位點雙酶切，同時也同樣的酶處理pMETA載體，連接轉化大腸桿菌E.coliDH5α，小量抽提質粒后進行雙酶切和PCR鑒定，電泳結果顯示條帶大小與預期相符(圖2)，測序結果也正確，表明目的基因已經(jīng)成功亞克隆至pMETA載體。

圖2 重組表達質粒pMETA/HA(52～1 557 bp)、pMETA/NA(121～1 263 bp)的酶切及PCR鑒定Fig.2 Enzyme digestion analysis and PCR identification of recombinant plasmid pMETA/HA(52?1 557 bp), pMETA/NA(121?1 263 bp).1: pMETA; 2: pMETA digested withBamH I;3: pMETA/HA(52?1 557 bp); 4: pMETA/HA(52?1 557 bp)digested withBamH I; 5: pMETA/HA(52?1 557 bp)digested withBamH I andNotI; 6: PCR for HA(52?1 557 bp); 7: pMETA/NA(121?1 263 bp); 8: pMETA/NA(121?1 263 bp)digested withEcoR I; 9: pMETA/NA(121?1 263 bp)digested withEcoR I andNotI; 10: PCR for NA(121?1 263 bp); M: DNA marker.

2.3 HA、NA蛋白抗原片段的表達

重組表達質粒經(jīng)AscI線性化，電轉化P.methanolicapMAD16，經(jīng)甲醇誘導3 d后，SDS-PAGE分析可見特異性表達帶，分子量比預期大，推測是蛋白表達后經(jīng)過了糖基化修飾?？扇苄苑治鲲@示此蛋白既有可溶性表達也有包涵體形式表達。

2.4 表達產(chǎn)物的純化

用 Ni-NTA agarose親和層析柱純化上清，在300 mmol/L咪唑洗脫時Bradford試劑有強烈的顏色變化，經(jīng)SDS-PAGE檢測，表明目的蛋白得到純化，占總蛋白的95%以上(圖3和圖4)。純化后的蛋白經(jīng)PBS透析后保存。

圖3 HA重組蛋白的表達和純化Fig.3 Expression and purification of HA.M: protein marker;1: pMAD16 before methanol induction; 2: pMAD16 after methanol induction; 3: ultrasonic supernatant after methanol induction; 4: crude extract of infusibility protein; 5: purified recombinant protein.

圖4 NA重組蛋白的表達和純化Fig.4 Expression and purification of NA.M: protein marker; 1:pMAD16 before methanol induction; 2: pMAD16 after methanol induction; 3: ultrasonic supernatant after methanol induction; 4:crude extract of infusibility protein; 5: purified recombinant protein.

2.5 純化產(chǎn)物抗原性的鑒定

ELISA檢測結果顯示：重組蛋白與兔抗流感病毒H1N1血清有陽性反應(數(shù)據(jù)未顯示)，提示表達的重組蛋白與病毒自身蛋白有相似的免疫原性。

Western blotting結果顯示重組蛋白與兔抗流感病毒H1N1血清反應有特異性條帶產(chǎn)生，分子量大小與預期一致(圖5)。

圖5 重組蛋白與兔抗禽流感病毒H1N1血清的Western blotting分析Fig.5 Western blotting analysis of recombinant protein and influenza virus H1N1 antiserum.Negative: pMAD16 control; M:prestained protein marker; H1: recombinant protein HA; N1:recombinant protein NA.

3 討論

流感病毒(Influenza virus，IV)屬于單股負鏈RNA 病毒，基因組大約為13.6 kb，由大小不等的8個基因片段組成。編碼PB2、PB1、PA聚合酶、血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基質蛋白M1和離子通道蛋白M2、非結構蛋白NS1、NEP共 10種不同的基因產(chǎn)物[11-12]。其中血凝素(Hemagglutinin，HA)基因屬于主要的保護性抗原，它不僅可以誘導特異性中和抗體產(chǎn)生，而且還可以刺激機體產(chǎn)生細胞毒性淋巴細胞(CTL)反應。另外，HA在病毒吸附、穿膜以及決定病毒的宿主特異性和致病力方面均起著關鍵作用。因此，HA 基因的變異程度將直接影響對該病毒的防治[13-14]。NA基因編碼的神經(jīng)氨酸酶(Neuramidinase，NA)蛋白也是AIV的主要表面抗原之一，具有水解唾液酸的活性，當成熟的流感病毒經(jīng)出芽的方式脫離宿主細胞之后，病毒表面的血凝素會經(jīng)由唾液酸與宿主細胞膜保持聯(lián)系，需要由神經(jīng)氨酸酶將唾液酸水解，切斷病毒與宿主細胞的最后聯(lián)系。有利于子代病毒粒子的成熟和釋放。NA的另一種作用是穿透呼吸道表面的黏膜，促進病毒在機體內的傳播，與病毒的宿主嗜性及毒力有關。NA是體液免疫的靶抗原，可誘導機體產(chǎn)生特異性抗體，抗體具有免疫保護作用，可抑制酶活性，抑制病毒從感染細胞釋放，從而減少病毒的增殖[15-17]。

H1N1流感病毒的流行范圍遍及全球且目前尚無有效地預防措施[18]，因此，H1N1病毒基因工程疫苗和快速診斷試劑的研制有著廣闊的前景。在臨床上進行 H1N1病毒感染的快速診斷時常需要獲得特異性強的高效價病毒抗體。而傳統(tǒng)的純化病毒方法制備病毒抗體費時、費力，且往往難以得到特異性較高的抗體。

本研究利用真核酵母菌表達系統(tǒng)具有成本低、操作簡單、生產(chǎn)周期短、表達產(chǎn)量高且表達的蛋白易于純化等優(yōu)點[19]。利用基因工程手段將HA、NA基因的信號肽缺失掉，采用真核表達載體 pMETA表達了缺失信號肽的HA和NA蛋白部分基因序列(HA(52～1 557 bp)，NA(121～1 263 bp))，我們對基因序列進行了分析，發(fā)現(xiàn)尾部150 bp是基因的穿膜區(qū)，與免疫原性無關且體外表達時會因為疏水性而影響表達，故決定截去尾部150 bp，結果獲得了高效表達，蛋白分子量大于預期，推測是糖基化修飾，純化效果也非常好，達到了95%以上。

免疫學鑒定確定表達的蛋白都具有較好的免疫反應性，后續(xù)的試驗將利用此重組蛋白進行單克隆抗體和免疫學快速檢測試劑的研制，本工作為研制開發(fā)相關的診斷試劑和基因工程疫苗打下了基礎。

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Expression of the hemagglutinin and neuramidinase gene of influenza A virus H1N1 in Pichia methanolica

Ye Zhang1, Zaijiang Yu1, Li Xin1, Yongkun Chen1, Qihui Tang2, Yubao Chen3, Qingxuan Chen2,and Yuelong Shu1
1 Department of Influertza, Nattonat Institute of Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100052, China 2 Beijing Biokit Science and Technology Limited Company, Beijing 100094, China 3 Sinogreen Institute for Bioeconomy, Beijing 102206, China

Received:January 23, 2010;Accepted:May 4, 2010

Supported by:National Science and Technology Pillar Program(No.2006BAD06A15).

Corresponding author:Yuelong Shu.Tel/Fax: +86-10-63577499; E-mail: yshu@vip.sina.com國家科技支撐計劃(No.2006BAD06A15)資助。