鄭嫻嫻，何金生，付遠(yuǎn)輝，徐少華，謝燦，石長信，張梅，王小波，洪濤,4

1 安徽醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，合肥 230032 2 北京交通大學(xué)生命科學(xué)與生物工程研究院，北京 100044 3 Division of Hematology-Oncology, Mayo Clinic, Scottsdale AZ 85259, USA 4 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京 100052

輔助病毒依賴型腺病毒載體轉(zhuǎn)基因的體外表達(dá)效率

鄭嫻嫻1,2，何金生1,2，付遠(yuǎn)輝2，徐少華2，謝燦1，石長信3，張梅1，王小波1,2，洪濤2,4

1 安徽醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，合肥 230032 2 北京交通大學(xué)生命科學(xué)與生物工程研究院，北京 100044 3 Division of Hematology-Oncology, Mayo Clinic, Scottsdale AZ 85259, USA 4 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京 100052

構(gòu)建可表達(dá)增強型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)的輔助病毒依賴型腺病毒載體(Helper-dependent adenoviral vector，HDAd)，并完成大量制備、純化和體外表達(dá)鑒定。熒光顯微鏡證實HDAd/EGFP可表達(dá)，電鏡下觀察到經(jīng) CsCl純化后的腺病毒的典型形態(tài)。分光光度計法測定病毒的濃度為 4.0×1012顆粒數(shù)(Virus particle，vp)/mL。與可表達(dá)EGFP的第一代腺病毒載體(First generation adenoviral vector，F(xiàn)GAd)FGAd/EGFP進行了體外感染和轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的比較研究，分別用約2 000 vp/細(xì)胞的HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測EGFP的表達(dá)情況。通過相同時間點流式細(xì)胞儀分析EGFP的表達(dá)情況，可見HDAd/EGFP感染早期的A549細(xì)胞較 FGAd/EGFP有更高的熒光表達(dá)率及更高的表達(dá)強度，顯示 HDAd載體具有轉(zhuǎn)基因瞬時高表達(dá)的特性，是一種更有價值的疫苗載體。

輔助病毒依賴型腺病毒載體，第一代腺病毒載體，增強型綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)基因表達(dá)

Abstract:To investigate the transgenic expressing efficacy of helper-dependent adenoviral vector(HDAd)in vitro, we constructed a HDAd encoding enhanced green fluorescent protein(EGFP), denominated as HDAd/EGFP, performed large scale preparation and purification, and then identified the purified HDAd/EGFP under fluorescent microscope and electron microscope.After the concentration of HDAd/EGFP was determined by spectrophotometer, the transgenic expression efficiency of HDAd/EGFP was compared with first generation adenoviral vector encoding EGFP(FGAd/EGFP)in vitro.Therefore, we infected A549 cells with 2 000 virus particles(vp)per cell by HDAd/EGFP and FGAd/EGFP respectively and analyzed EGFP expressing level by flow cytometry.Consequently, the fluorescent expression rate and fluorescent intensity ofEGFP were higher in early infected A549 cells by HDAd/EGFP than by FGAd/EGFP.HDAd, capable of expressing transgene instantly and efficiently in vitro, is a potential vaccine vector.

Keywords:helper-dependent adenoviral vector(HDAd), first generation adenoviral vector(FGAd), enhanced green fluorescent protein(EGFP), transgenic expression

輔助病毒依賴型腺病毒載體(Helper-dependent adenoviral vector，HDAd)是在第一代腺病毒載體(First generation adenoviral vector，F(xiàn)GAd)基礎(chǔ)上研制的一種全缺失的腺病毒載體[1]，僅含有腺病毒復(fù)制信號(ITRs)和包裝信號(Ψ)，需要輔助病毒為其提供包裝所需的所有蛋白。與 FGAd相比，HDAd具有轉(zhuǎn)基因容量大、轉(zhuǎn)基因表達(dá)時間長、安全性高等優(yōu)點，十多年來，HDAd主要用于基因治療，作為疫苗載體的研究起步較晚，通過肌肉或靜脈注射發(fā)現(xiàn) HDAd具有更強的誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對轉(zhuǎn)基因的免疫反應(yīng)[2-4]，我們通過滴鼻途徑免疫動物也獲得了類似的結(jié)果[5]。這種增強的免疫應(yīng)答主要與HDAd可在體內(nèi)高表達(dá)轉(zhuǎn)基因及減弱的載體反應(yīng)有關(guān)，關(guān)于這 2種載體體外轉(zhuǎn)基因表達(dá)情況的研究較少。

綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)為Shimomura等[6]于1962年從多管水母屬Aequorea victoria中首次分離獲得，1992年由Prasher等完成其 cDNA的克隆，其開放讀碼框(Open reading frame，ORF)編碼 238個氨基酸[7]。GFP無種屬特異性、可在不同種屬細(xì)胞或組織中穩(wěn)定發(fā)出熒光，熒光檢測不需要外加底物和輔助因子[8-9]。利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)可直接觀察[10]，無細(xì)胞毒性作用[8,11]，因此被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)與調(diào)控、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化及蛋白質(zhì)的胞內(nèi)定位和功能研究等方面，成為繼LacZ、CAT后國內(nèi)外分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的報告基因。增強型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)是經(jīng)過密碼子優(yōu)化及氨基酸突變等一些列基因改造后獲得的 GFP突變體[12]，這種突變體不僅保留了GFP的所有優(yōu)點，且更易于在真核細(xì)胞中表達(dá)，蛋白表達(dá)量增加，使EGFP表達(dá)的熒光強度比GFP高100倍以上，大大提高了檢測靈敏度[13]，而且因其具有 B細(xì)胞、Th細(xì)胞和CTL細(xì)胞表位[14-15]，成為一種應(yīng)用非常廣泛的示蹤蛋白和模式蛋白。

因此，本文以 EGFP作為報告基因，構(gòu)建可表達(dá)EGFP的 HDAd/EGFP載體，大量擴增純化及表達(dá)鑒定，并與FGAd/EGFP一起開展轉(zhuǎn)基因體外表達(dá)效率的比較研究，以期為HDAd作為疫苗載體的研究提供更全面的基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和毒株

HDAd Cre/loxP系統(tǒng)及 293Cre4細(xì)胞和輔助病毒H14購自加拿大Microbix公司，A549細(xì)胞由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)院魏海明教授饋贈，293細(xì)胞、CsCl超速離心純化的可表達(dá)EGFP的復(fù)制缺陷型重組腺病毒FGAd/EGFP由本室保存。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒

E.coliDH10B菌株由本實驗室保存，pSC11、pSC15B由美國梅奧醫(yī)院血液腫瘤科石長信博士構(gòu)建[16]。

1.1.3 主要試劑

限制性內(nèi)切酶PmeⅠ、I-SceⅠ、I-CeuⅠ購自美國New England Biolabs公司，SAP酶、DL 1 kb marker購自Fermentas公司，T4 DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、pfu酶購自上海 Promega公司，DL2000 marker、ExTaqDNA聚合酶、其他限制性內(nèi)切酶是TaKaRa公司的產(chǎn)品，質(zhì)粒提取及純化試劑盒、PCR產(chǎn)物回收及純化試劑盒購自美國Omega公司，引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PCR獲得CMV-EGFP-SV40片段

用 FGAd/EGFP按 500 vp/細(xì)胞感染豐度約為90℅的293細(xì)胞，待72 h后，收集細(xì)胞采用Hirt法快速提取腺病毒 DNA，以此為模板，用 PCR法擴增獲得目的片段 CMV-EGFP-SV40。上、下游引物分別為：5′-GTCGACTAGTAATCAATTACGGGG-3′和 5′-ACGCGTTAAGATACATTGATGAG-3′，并在引物5′端分別引入SalⅠ和MluⅠ的酶切位點。PCR條件：95℃預(yù)變性 5 min；94℃變性1 min，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；72℃最終延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

將 CMV-EGFP-SV40的 PCR回收產(chǎn)物與pGEM-T連接、轉(zhuǎn)化、挑菌、搖菌和小提質(zhì)粒，獲得質(zhì)粒命名為pGEM-T/EGFP，進行測序。測序鑒定正確后用SalⅠ和MluⅠ酶切pGEM-T/EGFP，切膠回收純化CMV-EGFP-SV40片段，置于?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 重組腺病毒質(zhì)粒pSC15B/EGFP的構(gòu)建

用SalⅠ和MluⅠ雙酶切pSC11，將CMV-EGFPSV40與pSC11連接、轉(zhuǎn)化、挑菌、搖菌，然后小提質(zhì)粒，用SalⅠ和MluⅠ酶切鑒定。獲得的重組質(zhì)粒命名為pSC11/EGFP。

用NheⅠ和PmeⅠ酶切pSC11/EGFP，T4 DNA聚合酶、T4 DNA連接酶進行末端補平及連接，去除PmeⅠ酶切位點，獲得重組質(zhì)粒命名為 pSC11/EGFPNheⅠ-PmeⅠ。

用 I-SceⅠ和 I-CeuⅠ雙 酶 切 pSC11/EGFPNheⅠ-PmeⅠ和pSC15B，進行連接、轉(zhuǎn)化、挑菌和搖菌。提取質(zhì)粒用Hind Ⅲ酶切鑒定，同時以Hind Ⅲ酶切 pSC15B作對照。得到連接成功的質(zhì)粒進一步用BamHⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、Hind Ⅲ、PstⅠ酶切鑒定，獲得的重組質(zhì)粒命名為pSC15B/EGFP[17]。

1.2.3 重組腺病毒HDAd/EGFP的獲得

用60 mm×15 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)293Cre4細(xì)胞待豐度達(dá)到90%左右時，取PmeⅠ酶切消化的pSC15B/EGFP線性化片段經(jīng)磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后第2天，棄掉培養(yǎng)液，加入含2% FBS的DMEM維持液。取輔助病毒H14，按500 vp/細(xì)胞感染293Cre4細(xì)胞，置 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。約48～72 h后，細(xì)胞完全病變、脫落，收集脫落后的細(xì)胞及上清，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，2 000 r/min離心5 min。棄部分上清，保留約4 mL，用吸管重懸沉淀，?80℃冰箱凍存30 min，37℃水浴融化，反復(fù)3次，獲得P0代HDAd/EGFP粗體液，取1 mL接種至形成單層、含2% FBS的DMEM維持液的293Cre4細(xì)胞中，同時按 100 vp/細(xì)胞加入輔助病毒，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞病變。約48 h后，細(xì)胞完全病變、脫落，按上法處理293Cre4細(xì)胞，重復(fù)6輪獲得P6代HDAd/EGFP粗提液[17]。

1.2.4 重組腺病毒HDAd/EGFP的大量制備及純化

用30個150 mm×25 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)293Cre4細(xì)胞，待細(xì)胞豐度約為90%時，取HDAd/EGFP和輔助病毒H14共感染293Cre4細(xì)胞，約48～72 h后，收集細(xì)胞及培養(yǎng)液。采用 CsCl密度梯度和連續(xù)密度梯度法 2次超速離心純化HDAd/EGFP，樣品在4℃、10 mmol/L Tris-HCl 8.0中透析24 h，期間換液 3次[17]。電鏡下觀察純化后病毒形態(tài)并保存于?80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 轉(zhuǎn)基因EGFP的表達(dá)鑒定

用100 mm×20 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)293Cre4細(xì)胞，待細(xì)胞豐度約為90%時，用純化的HDAd/EGFP感染293Cre4細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 分光光度計測定純化重組腺病毒HDAd/EGFP的病毒顆粒濃度

用含0.1℅ SDS的TE溶液稀釋純化的HDAd/EGFP，同時設(shè)置陰性對照。56℃溫育 10 min，渦旋振蕩樣品后使用分光光度計測OD260的值。根據(jù)公式計算純化重組腺病毒HDAd/EGFP的病毒顆粒濃度[18]：

病毒顆粒濃度(vp/mL)=(OD260值×稀釋倍數(shù)×1.1×1012×36)/HDAd/EGFP 堿基數(shù)(kb)

1.2.7 重組腺病毒HDAd/EGFP和FGAd/EGFP轉(zhuǎn)基因EGFP表達(dá)的比較

用 2塊 24孔板培養(yǎng)A549細(xì)胞，待豐度達(dá)到90%左右時，分別用2 000 vp/細(xì)胞的HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549細(xì)胞，同時以培養(yǎng)的正常A549細(xì)胞作為陰性對照。

在感染后1、3、8 d時分別隨機取HDAd/EGFP或FGAd/EGFP感染的A549細(xì)胞各3孔，棄培養(yǎng)液，用PBS液洗滌2遍后用0.25%胰酶消化，鏡下觀察待呈單個貼壁細(xì)胞時，棄胰酶，用PBS液吹打成單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測每10 000個A549細(xì)胞的EGFP表達(dá)率和EGFP平均熒光強度。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用 SPSS11.5統(tǒng)計學(xué)軟件對重組腺病毒HDAd/EGFP和FGAd/EGFP轉(zhuǎn)基因EGFP表達(dá)率和表達(dá)強度進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組比較使用單因素多組方差分析，當(dāng)方差不齊時使用t檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 PCR獲得EGFP表達(dá)盒

以 FGAd/EGFP為模板，用 PCR法擴增獲得EGFP表達(dá)盒CMV-EGFP-SV40片段，1℅瓊脂糖凝膠電泳，觀察到介于1 000～2 000 bp的DNA片段，與預(yù)期值 1 627 bp相符(圖1)?；厥盏?CMVEGFP-SV40片段與pGEM-T連接，測序正確。

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果Fig.1 PCR product of CMV-EGFP-SV40.1: DL2 000 marker;2: PCR product of CMV-EGFP-SV40.

2.2 構(gòu)建 HDAd/EGFP重組質(zhì)粒 pSC15B/EGFP及酶切鑒定

將CMV-EGFP-SV40克隆至載體pSC11，SalⅠ和MluⅠ酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示得到2條帶，約為3 000 bp和1 600 bp，與pSC11、CMVEGFP-SV40大小一致(圖2)。為進一步將EGFP表達(dá)盒克隆至pSC15B，需去除pSC11/EGFP中的PmeⅠ酶切位點，用NheⅠ和PmeⅠ酶切pSC11/EGFP，末端補平、連接后用PmeⅠ和XbaⅠ進行酶切鑒定，可觀察到5 000 bp左右的線性化條帶，證實已去除了PmeⅠ酶切位點。

進一步克隆EGFP基因至pSC15B，大提質(zhì)粒并用BamHⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、Hind Ⅲ、PstⅠ酶切鑒定，與預(yù)計結(jié)果一致(圖3)。

2.3 超速離心純化后病毒帶的觀察

HDAd/EGFP與輔助病毒 H14共感染 293Cre4細(xì)胞進行擴增，經(jīng)CsCl密度梯度和連續(xù)密度梯度超速離心純化后，在管的中下部可見到上下2條乳白色病毒帶，上面的帶即為純化后的HDAd/EGFP(圖4)。

2.4 電鏡鑒定重組腺病毒HDAd/EGFP形態(tài)

純化后的 HDAd/EGFP經(jīng)磷酸鎢負(fù)染，在透射電鏡下可見腺病毒典型的二十面體結(jié)構(gòu)，直徑約為70 nm，病毒結(jié)構(gòu)完整(圖5)。

圖2 酶切鑒定pSC11/EGFPFig.2 pSC11/EGFP identified by restriction endonuclease assay.1: DL2 000 marker; 2: pSC11/EGFP digested withSalⅠandMluⅠ.

圖3 酶切鑒定pSC15B/EGFPFig.3 pSC15B/EGFP identified by restriction endonuclease assay.1:PstⅠ; 2:EcoRⅤ; 3:EcoRⅠ; 4:BamHⅠ; 5:HindⅢ;M: DL1kb marker.

圖4 經(jīng)CsCl超速離心后HDAd/EGFP病毒條帶Fig.4 HDAd/EGFP purified by CsCl ultracentrifugation.

圖5 純化的 HDAd/EGFP電鏡下形態(tài)(1%磷鎢酸pH 6.8負(fù)染，TECNAI-12)Fig.5 Purified HDAd/EGFP under electron microscope(TECNAI-12).

2.5 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因EGFP的表達(dá)

將純化后的 HDAd/EGFP感染 293Cre4細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察可見明顯的綠色熒光(圖6)。

2.6 重組腺病毒HDAd/EGFP濃度計算

圖6 HDAd/EGFP感染 293Cre4細(xì)胞后表達(dá)的 EGFP(Nikon TE2000-S，100×)Fig.6 EGFP expressed by HDAd/EGFP infected 293Cre4 cells(Nikon TE2000-S, 100×).

純化后的HDAd/EGFP稀釋10倍后測得OD260值為0.33，HDAd/EGFP堿基數(shù)為33.089 kb，可得HDAd/EGFP 的病毒顆粒濃度為：(0.33×10×1.1×1012×36)/33.089≈4.0×1012vp/mL。

2.7 流式細(xì)胞儀檢測HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549細(xì)胞后EGFP的表達(dá)

以2 000 vp/細(xì)胞的HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測A549細(xì)胞的熒光表達(dá)率和表達(dá)強度。

圖7 A549細(xì)胞感染后1天時的流式直方圖Fig.7 Flowcytometric histograms of infected A549 cells on day 1 after HDAd/EGFP or FGAd/EGFP infection(BECKMAN COULTER XL).(A)A549 cells.(B)FGAd/EGFP infected A549 cells.(C)HDAd/EGFP infected A549 cells.

圖8 A549細(xì)胞感染后3天時的直方細(xì)胞圖Fig.8 Flowcytometric histograms of infected A549 cells on day 3 after HDAd/EGFP or FGAd/EGFP infection(BECKMAN COULTER XL).(A)A549 cells.(B)FGAd/EGFP infected A549 cells.(C)HDAd/EGFP infected A549.

圖9 A549細(xì)胞感染后8天時的直方細(xì)胞圖Fig.9 Flowcytometric histograms of infected A549 cells on day 8 after HDAd/EGFP or FGAd/EGFP infection(BECKMAN COULTER XL).(A)A549 cells.(B)FGAd/EGFP infected A549 cells.(C)HDAd/EGFP infected A549.

圖10 HDAd/EGFP、FGAd/EGFP感染 A549細(xì)胞后EGFP的表達(dá)率分析Fig.10 Percentage of EGFP expressed A549 cells after HDAd/EGFP or FGAd/EGFP infection(BECKMAN COULTER XL).

圖11 HDAd/EGFP、FGAd/EGFP感染 A549細(xì)胞后EGFP的熒光強度Fig.11 Fluorescence intensity of EGFP expressed by A549 cells after HDAd/EGFP or FGAd/EGFP infection(BECKMAN COULTER XL).

圖7、圖8、圖9分別顯示A549細(xì)胞感染重組腺病毒后 1、3、8 d時流式細(xì)胞儀所檢測得到的流式直方圖。圖7A、圖8A、圖9A為A549細(xì)胞作為陰性對照，設(shè)置M1區(qū)域，圖7B/C、圖8B/C、圖9B/C中M2區(qū)代表有EGFP表達(dá)的A549細(xì)胞。圖10顯示感染 HDAd/EGFP的 A549細(xì)胞在感染后的第 1天和第3天較FGAd/EGFP有更高的EGFP表達(dá)率(P＜0.05)，在第8天兩者沒有明顯差異(P＞0.05)；圖11顯示感染HDAd/EGFP的A549細(xì)胞在感染后第 1天和第 3天，EGFP的平均熒光強度均比FGAd/EGFP強(P＜0.05)，在第 8天兩者的平均熒光強度沒有明顯差異(P＞0.05)。

3 討論

腺病毒為長約36 kb的線性雙鏈DNA病毒，無包膜，具有宿主范圍廣、可感染分裂和非分裂細(xì)胞、外源基因容納量大、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、病毒滴度高、易繁殖和純化等優(yōu)點[19]，被廣泛應(yīng)用于基因治療和疫苗研究中。FGAd由于保留了腺病毒的大部分基因，低水平表達(dá)的腺病毒蛋白不僅對轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，在體內(nèi)也可引起針對腺病毒載體的免疫反應(yīng)，當(dāng)再次使用腺病毒載體時，容易被機體免疫系統(tǒng)快速清除而無法長期表達(dá)轉(zhuǎn)基因[20]。HDAd又被稱為空殼載體(Gutless or gutted vector)，缺失除了腺病毒復(fù)制信號(ITRs)和包裝信號(Ψ)以外的其他所有腺病毒基因，感染后無病毒自身蛋白表達(dá)[1]，大大降低了細(xì)胞毒性和機體的免疫反應(yīng)[20]，可以持續(xù)表達(dá)轉(zhuǎn)基因達(dá)1年以上[21]，安全性更好；大量病毒自身基因的缺失使得HDAd的外源基因容納量高達(dá)37 kb，可同時表達(dá)多個基因用于多基因疾病的研究[22]；另外，HDAd在包裝過程中需要借助輔助病毒為其提供所有的結(jié)構(gòu)和功能蛋白，來源于不同血清型的輔助病毒，可形成不同血清型的腺病毒，避免反復(fù)使用同一血清型腺病毒載體所產(chǎn)生的中和抗體的影響[23]。

本實驗對HDAd和FGAd體外感染轉(zhuǎn)基因表達(dá)率和表達(dá)強度進行了比較，我們分別用約2 000 vp/細(xì)胞的HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549細(xì)胞，結(jié)果顯示感染HDAd/EGFP的細(xì)胞3 d內(nèi)EGFP的表達(dá)率高于FGAd/EGFP感染的細(xì)胞，隨著時間的推移2組 EGFP的表達(dá)率無統(tǒng)計學(xué)差異，提示在體外感染肺泡來源的上皮細(xì)胞后，感染的早期HDAd較FGAd有更高的轉(zhuǎn)基因表達(dá)率；同時我們監(jiān)測了 HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549細(xì)胞后EGFP的表達(dá)強度，結(jié)果同樣顯示在感染后3天內(nèi)HDAd/EGFP較FGAd/EGFP有更高的EGFP表達(dá)，隨著時間的推移 2組的表達(dá)率也無統(tǒng)計學(xué)差異，說明感染早期HDAd在體外感染的肺泡上皮來源的細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)較 FGAd具有一定優(yōu)勢。我們的結(jié)果與文獻報道的體內(nèi)結(jié)果基本一致[2-3]。由于HDAd/EGFP和FGAd/EGFP均為5型腺病毒來源，具有相同的衣殼蛋白，HDAd/EGFP較FGAd/EGFP有更高的體外轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的原因，目前仍不是十分清晰，我們推測：1)FGAd/EGFP除了含有EGFP表達(dá)盒外，還含有17個腺病毒蛋白的ORF[3]，雖然缺失了E1和E3區(qū)，仍存在的低水平表達(dá)會影響或干擾EGFP的表達(dá)，而 HDAd/EGFP僅有一個 EGFP表達(dá)盒，不存在任何腺病毒蛋白的干擾，因此轉(zhuǎn)基因的表達(dá)更加迅速、高效；2)兩種載體轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率趨向一致的時間長短，與細(xì)胞生長狀況有關(guān)，細(xì)胞活性的下降直接影響了HDAd轉(zhuǎn)基因的高效表達(dá)。我們認(rèn)為HDAd載體這種轉(zhuǎn)基因瞬時高表達(dá)的特性是其作為疫苗載體，獲得比 FGAd載體更好的免疫原性的重要原因之一。需要指出的是轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平由多種因素決定，不僅與載體有關(guān)，也與轉(zhuǎn)基因本身的生物學(xué)性質(zhì)如細(xì)胞毒性作用等有關(guān)，這些因素會對HDAd的轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率產(chǎn)生一定影響。

由于大多數(shù)病毒通過黏膜途徑，尤其是呼吸道入侵機體，因此我們認(rèn)為應(yīng)及時開展HDAd作為黏膜免疫載體的可行性及效率研究，以期為開發(fā)RSV等經(jīng)黏膜途徑感染的病毒疫苗探索一條新的途徑。鑒于這種認(rèn)識，我們選擇了具有較好的免疫原性、不抑制機體的免疫應(yīng)答[3,15-16]、也沒有細(xì)胞毒性的EGFP作為模式蛋白，用于探討 HDAd作為黏膜疫苗載體的可行性，避免轉(zhuǎn)基因?qū)DAd免疫效果不利的影響，以期真實反映HDAd作為黏膜疫苗載體的可行性。進一步的實驗證實了我們的想法，經(jīng)滴鼻途徑免疫 BALB/c小鼠的比較研究表明：HDAd/EGFP能誘導(dǎo)產(chǎn)生更好的體液、細(xì)胞及黏膜免疫應(yīng)答，具有Th1和Th2平衡的特點，HDAd/EGFP加強(Boost)免疫具有明顯的免疫增強效果。證實了HDAd作為黏膜疫苗載體用于預(yù)防經(jīng)呼吸道黏膜途徑感染的RSV等病毒病原的疫苗研究是合理、可行的，將有助于克服目前RSV等疫苗研究中存在的安全性不足、免疫效果不理想等問題，作為安全有效的黏膜疫苗載體，HDAd具有較好的應(yīng)用前景[5]。

總之，我們已成功構(gòu)建了 HDAd/EGFP載體，獲得可高效表達(dá)EGFP的HDAd/EGFP，并在體外開展了轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的初步研究，與 FGAd載體相比，HDAd載體具有轉(zhuǎn)基因瞬時高表達(dá)的特性，證實HDAd是很有潛力的疫苗載體。

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In vitro transgenic expression efficacy of a helper-dependent adenoviral vector encoding enhanced green fluorescent protein

Xianxian Zheng1,2, Jinsheng He1,2, Yuanhui Fu2, Shaohua Xu2, Can Xie1, Changxin Shi3,Mei Zhang1, Xiaobo Wang1,2, and Tao Hong2,4
1 Department of Immunology, Anhui Medical University, Hefei 230032, China 2 College of Life Sciences & Bioengineering, Beijing Jiaotong University, Beijing 100044, China 3 Division of Hematology-Oncology, Mayo Clinic, Scottsdale AZ 85259, USA 4 Institute of Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100052, China

Received:February 21, 2010;Accepted:April 28, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China(No.30671965).

Corresponding author:Jinsheng He.Tel: +86-10-51684080; Fax: +86-10-51683887; E-mail: jshhe@bjtu.edu.cn國家自然科學(xué)基金(No.30671965)資助。