延邊大學農學院動物科學系 張秋華 張 敏

菌體蛋白飼料富含蛋白質，還具有一定香味，營養(yǎng)價值較高 （曹鈺等，2007）。由于其具有成本低、原料廣、周期短、產(chǎn)量高等優(yōu)點而成為目前研究的熱點。本試驗以雜粕（豆粕、玉米臍子粕、菜籽粕、棉籽粕）為基質，利用酵母菌進行固態(tài)發(fā)酵，通過單因素試驗設計對其發(fā)酵周期、接種量、料水比、溫度、氮源添加量等因素進行研究，以確定菌體蛋白飼料的最佳發(fā)酵生產(chǎn)條件。

1 材料與方法

1.1 材料 雜粕市售，其主要成分為：玉米5%、豆粕20%、玉米臍子粕25%、菜籽粕10%、棉籽粕24%。

高活性干酵母，由某酵母公司提供。

1.2 培養(yǎng)基 選擇培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，酵母粉0.5 g，蛋白胨 1 g，丙酸鈉 0.25 g，瓊脂 2 g，水 100 mL，pH 4.5。

液體培養(yǎng)基（YPD）：葡萄糖 2 g，酵母粉0.5 g，蛋白胨 1 g，水 100 mL，pH 4.5。

斜面培養(yǎng)基：土豆50 g，葡萄糖 5 g，瓊脂5 g，水 250 mL，pH 自然。

1.3 液體菌種培養(yǎng) 取一定量干酵母粉制成懸液，將其稀釋涂單菌落平板，將單菌落挑至含有100 mL YPD培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在恒溫搖床30℃振蕩培養(yǎng)24 h左右，搖床轉速130 r/min，制得酵母懸液含孢量為2.4×108～2.6×108個/mL。后轉移到冰箱中備用。

1.4 粗蛋白質含量的測定 采用凱氏定氮法。計算公式如下：

粗蛋白質含量=[（V2-V0）×N×0.0140×6.25]/[m×（V1/V）]×100%；

式中V0為滴定空白時所需鹽酸溶液體積，mL；V1為試樣分液蒸餾用體積，mL；V2為滴定試樣時所需鹽酸標準溶液體積，mL；V為試樣分解液總體積，mL；C為鹽酸標準溶液的物質的量濃度，mol/L；m 為試樣質量，g；0.0140 為 1 mmol氮的克數(shù)；6.25為氮的蛋白質換算系數(shù)。

2 結果與分析

2.1 原料的不同處理對粗蛋白質含量的影響將固體培養(yǎng)基分成兩組，每組培養(yǎng)基5 g。一組進行蒸汽滅菌為熟料（121℃，滅菌20 min），另一組不進行任何處理為生料。將酵母菌懸液取1 mL接種于生料和熟料中，加入適量的水分、氮源，在30℃下用恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，結果見表1。表1結果表明，熟料發(fā)酵后較生料未滅菌發(fā)酵后粗蛋白質含量明顯增加?？赡苁墙?jīng)熱處理后破壞了雜粕中的抗營養(yǎng)因子，更易于微生物吸收營養(yǎng)基質使其更好地增殖；另外，其內部化學鍵的斷裂也促使雜粕中的營養(yǎng)物質最大可能地轉化為菌體蛋白。

表1 生料與熟料發(fā)酵后粗蛋白質含量

2.2 發(fā)酵周期對發(fā)酵效果的影響 見圖1。

圖1 發(fā)酵時間對發(fā)酵效果的影響

發(fā)酵周期會影響發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質含量。發(fā)酵周期過短，菌體不能充分生長，導致發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質含量過低；發(fā)酵周期過長，生產(chǎn)成本增加，且容易滋生雜菌 （司翔宇等，2005）。圖1結果表明，通過接種量 4%，料水比 1∶1.2，溫度 30℃，氮源添加量3.5%（1.5%尿素+2.0%硫酸銨）發(fā)酵后，隨著發(fā)酵時間的遞增，菌體蛋白含量呈先上升后又逐漸下降的趨勢，發(fā)酵雜粕（熟料，下同）粗蛋白質含量在24 h時含量最高，為56.24%。其原因可能是酵母菌的呼吸作用消耗了部分有機物而產(chǎn)生了蛋白質的“濃縮效應”（張紅和西寧，1996），使雜粕中的營養(yǎng)物質慢慢被耗竭。

2.3 接種量對發(fā)酵效果的影響 見圖2。接種量過大，會使微生物生長速率過快，營養(yǎng)物質很快消耗，并釋放大量的熱能，容易導致溫度過高使菌體失活，同時也增加了生產(chǎn)成本；過小反而容易感染雜菌不利于發(fā)酵。圖2結果表明，在24 h，料水比1∶1.2，溫度 30℃，氮源添加量 3.5%（1.5%尿素+2.0%硫酸銨）發(fā)酵后，隨著接種量的增加，曲線表現(xiàn)為逐漸上升至最大值后小幅下降，雜粕粗蛋白質含量在6%接種量時含量最高，為55.47%。這可能是因為發(fā)酵前期菌體快速增長致使發(fā)酵后期營養(yǎng)供應不足，而使菌體產(chǎn)生自溶現(xiàn)象，使菌體蛋白含量下降。

圖2 接種量對發(fā)酵效果的影響

2.4 料水比對發(fā)酵效果的影響 見圖3。

圖3 料水比對發(fā)酵效果的影響

水分的控制在飼料發(fā)酵過程中非常重要，若原料過干，則菌株生長緩慢，得到的產(chǎn)品干枯，無酸香味；若原料水分過大，使料黏結則造成通氣困難，易使原料腐敗變質。圖3結果表明，通過接種量 6%，24 h，溫度 30℃，氮源添加量3.5%（1.5%尿素+2.0%硫酸銨）發(fā)酵后，雜粕粗蛋白質含量在料水比1∶1.4時含量最高，為55.29%。

2.5 溫度對發(fā)酵效果的影響 見圖4。

圖4 溫度對發(fā)酵效果的影響

溫度是影響有機體存活和生長的重要因素之一。若溫度過高，蛋白質可能受到不可逆的破壞，溫度過低又抑制了酶的活性，蛋白質的合成速度降低（周德慶，1996）。圖4結果表明，通過接種量6%，料水比 1∶1.4，24 h，氮源添加量 3.5%（1.5%尿素+2.0%硫酸銨）發(fā)酵后，隨著溫度的增加，菌體蛋白含量先小幅度上升，達到極值后又迅速下降，雜粕粗蛋白質含量在30℃時含量最高，為51.63%。可能由酵母菌反應速率逐漸加快，蛋白質轉化率明顯上升，隨著溫度繼續(xù)升高酶蛋白變性失活，導致蛋白質轉化率下降所致。

2.6 氮源添加量對發(fā)酵效果的影響 微生物發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白時，需要較高的氮濃度，以促使微生物盡可能地利用無機氮源合成蛋白質。其來源有兩方面：培養(yǎng)料自身的含氮物質和外界加入的含氮物質。通常外界加入的氮源對微生物生長有更明顯的作用（Emtiazi等，2003）。本試驗采用混合氮源，氮源配比見表2。

表2 氮源配比%

圖5結果表明，通過接種量6%，料水比1∶1.4，30℃發(fā)酵24 h后，隨著氮源添加量的增加，蛋白質含量呈先上升后下降的趨勢。雜粕粗蛋白質含量在3.5%（1.5%尿素+2.0%硫酸銨）時含量最高，為57.76%。這可能是由于加入的無機氮源通過微生物代謝轉化為蛋白質，造成蛋白質的絕對數(shù)量大幅度地增加。

3 小結

圖5 氮源對發(fā)酵效果的影響

本試驗利用酵母菌對雜粕進行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)在接種量6%、料水比1∶1.4、氮源添加量3.5%（1.5%尿素+2.0%硫酸銨）、溫度 30℃、發(fā)酵24 h的條件下，發(fā)酵終產(chǎn)物粗蛋白質含量達到57.76%，比發(fā)酵前（即空白對照組）提高了18.82個百分點 （即粗蛋白質的提高率為48.33%），效果較理想。但有關發(fā)酵雜粕對動物生理和生產(chǎn)性能的影響有待進一步研究。

[1]曹鈺，蔡國林，陸健.提高豆粕營養(yǎng)價值的研究進展[J].新飼料，2007，6：13～15.

[2]司翔宇，葛蕾，李志西.蘋果渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的研究[J].飼料研究，2005，3：35 ～ 37.

[3]張紅，西寧.固態(tài)發(fā)酵飼料酵母對非蛋白氮轉化能力的研究[J].飼料工業(yè)，1996，17（2）：17 ～ 19.

[4]周德慶.微生物學教程[M].北京：高等教育出版社，1996.4.

[5]Emtiazi G，Etemadifar Z，Tavassoli M.A novel nitrogen-fixing cellulytic bacterium associated with root of corn is a candidate for production of single cellprotein[J].Biomass and Bioenergy，2003，25（4）：423 ～ 426.