楊海朋，陳東成，李春輝，陳仕國(guó)，戈早川

（深圳大學(xué)材料學(xué)院，深圳市特種功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518060）

0 引言

有機(jī)磷農(nóng)藥作為最常用的一類(lèi)農(nóng)藥，在各種農(nóng)作物尤其是瓜果蔬菜中被廣泛應(yīng)用，農(nóng)藥殘留通過(guò)食物鏈傳導(dǎo)到人體后成為致畸、致癌、致突變等惡性疾病的誘因，危害很大,因此對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥等的檢測(cè)需求越來(lái)越多。測(cè)試的方法主要有儀器分析法、免疫分析法和生物傳感器法[1～2]。目前廣泛使用的氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/MS)和高效液相色譜(HPLC)等儀器分析方法,盡管能比較準(zhǔn)確地檢測(cè)農(nóng)藥的殘留量,但存在設(shè)備大、移動(dòng)性差、分析費(fèi)用高以及分析周期較長(zhǎng)等不足。免疫分析法特異性強(qiáng),但操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)。電化學(xué)生物傳感器的應(yīng)用為實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥快速、靈敏和簡(jiǎn)便的檢測(cè)提供了可能，已經(jīng)廣泛用于有機(jī)磷農(nóng)藥的測(cè)定[1,3～5]。但是電化學(xué)生物傳感器通常僅在一定的實(shí)驗(yàn)條件下使用狀態(tài)良好,其實(shí)際應(yīng)用的最大問(wèn)題是穩(wěn)定性不夠好。對(duì)于生物傳感器而言，制備新型固定化材料和固定化方法，改善傳感器的生物敏感膜的性能，增加其穩(wěn)定性和生物活性，是研制性能優(yōu)良的生物傳感器的關(guān)鍵[6]。

碳納米管(CNT)所表現(xiàn)出的許多優(yōu)良的性能使得對(duì)CNT的研究成為目前倍受關(guān)注的熱點(diǎn)課題之一，其在生物傳感器領(lǐng)域的應(yīng)用也不斷被拓展[3,7～8]。例如研究人員把碳納米管分散于Nafion[9～10]、殼聚糖[11～12]等高聚物的溶液中制備的生物傳感器，具有很好的檢測(cè)靈敏度。然而，能夠用于分散碳納米管的此類(lèi)高聚物非常有限。該課題利用環(huán)糊精作為分散劑來(lái)分散CNT，得到不溶于水的聚環(huán)糊精-碳納米管復(fù)合導(dǎo)電膜，并在該膜上固定乙酰膽堿酯酶，制備了既能保持CNT優(yōu)良的導(dǎo)電性能和電催化活性，又能維持很好的穩(wěn)定性的有機(jī)磷農(nóng)藥生物傳感器，為其實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑和儀器

試劑：多壁碳納米管(MWNT)，外徑10 nm，純度95%（清華大學(xué)化工系生產(chǎn)）。乙酰膽堿酯酶 （AChE）， 酶活力為424單位/毫克 （sigma公司）；氯化硫代乙酰膽堿（sigma公司）。其它試劑，如 β-環(huán)糊精（β-CD）、甲胺磷、濃硝酸、25%戊二醛（GD）、鹽酸、鐵氰化鉀、無(wú)水乙醇等均為分析純?cè)噭：膫€(gè)環(huán)糊精分子的預(yù)聚環(huán)糊精由實(shí)驗(yàn)室自制（β-CDP）。

主要儀器：電化學(xué)工作站(CHI660C)，上海辰華儀器有限公司。

1.2 傳感器制備

把碳納米管放入混酸（濃硫酸和濃硝酸按體積比3∶1）中于60°C回流4 h除雜。把CNT放入β-CD和β-CDP的混合溶液超聲10 min。混合液中CNT的濃度為1 mg/mL。

用微量進(jìn)樣器吸取混合液20 μL置于干凈的玻璃片上，加入 40 μL 2.5%戊二醛和 0.2 mol/L鹽酸的等比例混合液。攪拌均勻后，用微量進(jìn)量器吸取20 μL上述溶液滴到Pt電極上，室溫下自然晾干后得到聚環(huán)糊精-碳納米管（CDP-CNT）復(fù)合膜修飾電極。然后取5 μL乙酰膽堿酯酶溶液（0.1 U/μL）和 5 μL 2.5% 的戊二醛溶液滴到已干燥的復(fù)合膜修飾電極上，室溫下自然晾干，即得到聚環(huán)糊精-碳納米管復(fù)合膜有機(jī)磷農(nóng)藥生物傳感器。

1.3 有機(jī)磷農(nóng)藥傳感器的性能測(cè)試

利用CHI660C電化學(xué)工作站對(duì)制備的傳感器進(jìn)行循環(huán)伏安檢測(cè)。采用三電極系統(tǒng)（參比電極為飽和甘汞電極，對(duì)電極為鉑絲電極，工作電極為有機(jī)磷農(nóng)藥傳感器）測(cè)量傳感器在不同濃度甲胺磷抑制條件下對(duì)硫代乙酰膽堿溶液的電流響應(yīng)曲線(xiàn)。

2 結(jié)果討論

2.1 β-CD及β-CDP配比對(duì)修飾電極電化學(xué)性能的影響

把不同配比的β-CD和β-CDP修飾電極置于50 mmol/L的鐵氰化鉀（K3Fe(CN)6）溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)試，所得曲線(xiàn)如圖1所示。由圖可知，2%β-CD和5%β-CDP混合溶液分散CNT制備的復(fù)合膜修飾電極的氧化-還原峰峰形對(duì)稱(chēng)性最好，峰值最大，說(shuō)明CNT在以2%β-CD+5%β-CDP為基底組成的復(fù)合膜中分散效果最好，其修飾電極電化學(xué)性能優(yōu)異。

2.2 有機(jī)磷農(nóng)藥生物傳感器的性能檢測(cè)

2.2.1 循環(huán)伏安曲線(xiàn)

圖1 四種不同配比的β-CD和β-CDP制成的CDP-CNT復(fù)合膜修飾電極在50 mmol/L的鐵氰化鉀溶液中的循環(huán)伏安曲線(xiàn)圖（掃描速度50 mV/s）Fig.1 The cyclic voltammetry curves of four different types of modified electrodes:the modified materials on the electrodes are the films prepared via 2%β-CD+5%β-CDP,2%β-CD+8% β-CDP,2%β-CD+2%β-CDP,and 5%β-CDP,respectively(50 mmol/L K3Fe(CN)6at 50 mV/s)

把制備好的有機(jī)磷農(nóng)藥生物傳感器分別放入磷酸緩沖溶液和0.5 mmol/L氯化硫代乙酰膽堿溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)試，電壓掃描范圍為-0.4 至 0.8 V，掃描速度 0.1 V/s，掃描結(jié)果見(jiàn)圖 2。由圖可見(jiàn)，傳感器在不含底物的緩沖溶液中沒(méi)有明顯的氧化還原峰；在含有0.5 mmol/L底物的溶液中，則在0.4 V和0.1 V附近出現(xiàn)明顯的氧化還原峰。膽堿在普通電極上的氧化電位為0.8 V左右[13]，而在目前的傳感器電極上氧化電位降低為約0.4 V，說(shuō)明碳納米管對(duì)底物具有良好的電催化活性。

圖2 有機(jī)磷農(nóng)藥生物傳感器在磷酸緩沖溶液和0.5 mmol/L乙酰膽堿溶液中的循環(huán)伏安曲線(xiàn)（電壓掃描范圍為-0.4 至 0.8 V，掃描速度 0.1 V/s）Fig.2 The cyclic voltammetry curves of the biosensor in 0.5 mmol/L acetylthiocholine chloride solution and in PBS.The scan rate is 0.1 V/s

2.2.2 抑制率曲線(xiàn)的測(cè)量

在0.5 V工作電壓下，用傳感器測(cè)定5×10-4mol/L硫代乙酰膽堿溶液的電流響應(yīng)曲線(xiàn)，所得電流為基準(zhǔn)電流i0。把制好的傳感器在濃度分別為1.0、2.0、4.0 、6.0、10.0、15.0 mg/L 的甲胺磷溶液里浸泡12 min，分別測(cè)定其在相同濃度硫代乙酰膽堿溶液中的抑制電流ii。根據(jù)公式K=(ii-i0)/ii×100℅計(jì)算抑制率。抑制率-濃度關(guān)系曲線(xiàn)示于圖3。有機(jī)磷的濃度越大，對(duì)酶的活性的抑制力就越強(qiáng)，加入相同濃度的乙酰膽堿溶液時(shí)產(chǎn)生的響應(yīng)電流就越小。以有機(jī)磷農(nóng)藥濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)做圖，則得到圖3中的插圖?？梢?jiàn)當(dāng)甲胺磷濃度在 1.0～15.0 mg/L范圍內(nèi)時(shí)，抑制率與濃度數(shù)值的對(duì)數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系，檢測(cè)范圍較文獻(xiàn)值更寬[1]。圖中直線(xiàn)部分的擬合線(xiàn)性方程為 y=11.8*ln(c)+44.8，r=0.992(n=6),方程中 c是以mg/L為單位的有機(jī)磷濃度。理論上的檢測(cè)限是指10%的抑制率所對(duì)應(yīng)的抑制劑濃度，因此可計(jì)算得到該傳感器對(duì)甲胺磷的檢測(cè)下限為0.05 mg/L。

圖3 乙酰膽堿酯酶百分抑制率與甲胺磷農(nóng)藥濃度關(guān)系圖(內(nèi)置圖為抑制率-濃度的對(duì)數(shù)關(guān)系圖)Fig.3 Acetylcholinesterase percent inhibition vs Methamidophos concentrations incubated in phosphate buffer solution.Calibration graph of acetylcholinesterase percent inhibition vs.logarithm of concentration of Methamidophos is shown in the inset

為了研究傳感器的工作機(jī)理，測(cè)定了不同掃描速度下傳感器在硫代乙酰膽堿溶液中的循環(huán)伏安曲線(xiàn)（電壓掃描范圍為-0.4至0.8 V，掃描速度從 0.01 至 0.5 V/s），所得結(jié)果示于圖 4A。 圖中從最內(nèi)圈的循環(huán)伏安曲線(xiàn)開(kāi)始，所用的掃描速度分 別 是 0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 V/s。

圖4 (A)不同掃描速度下傳感器在氯化硫代乙酰膽堿溶液(0.5 mmol/L)中的循環(huán)伏安曲線(xiàn)（電壓掃描范圍為 -0.4 至 0.8 V，掃描速度從內(nèi)圈到外圈依次為 0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 V/s）;(B)不同掃描速度下的循環(huán)伏安曲線(xiàn)的峰電流分別對(duì)掃描速度（ν）、掃描速度的1/2次方（ν1/2）及掃描速度的3/4次方（ν3/4）圖Fig.4 (A)Cyclic voltammetry curves of AChE/CDP/CNT sensor in 0.5 mmol/L acetylthiocholine chloride solution at scan rates of:0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 V/s;(B)Fitting curves of peak current vs.(i)sweep rate(ν),(ii)the square root of sweep rate(ν1/2)and(iii)the three fourth power of sweep rate(ν3/4)

以各次循環(huán)伏安曲線(xiàn)的峰電流分別對(duì)ν、ν1/2及ν3/4做圖，所得曲線(xiàn)示于圖4B。根據(jù)已有研究結(jié)果，如果峰電流對(duì)掃描速度成正比，說(shuō)明電極的電子傳遞過(guò)程受表面反應(yīng)（電子轉(zhuǎn)移）步驟控制；如果峰電流對(duì)掃描速度的1/2次方成正比，說(shuō)明電極的電子傳遞過(guò)程受擴(kuò)散步驟控制。 由圖4B可見(jiàn)，在傳感器電極上發(fā)生的電極反應(yīng)與這兩種情況都不符合，而是與掃描速度的3/4次方成正比。說(shuō)明傳感器的電子傳遞過(guò)程同時(shí)受表面反應(yīng)和擴(kuò)散兩種電極反應(yīng)機(jī)理控制。 通常固定化酶的電極反應(yīng)都是由擴(kuò)散控制機(jī)理起主要作用。據(jù)此可認(rèn)為，由于碳納米管的加入，縮短了酶與電極、底物與基礎(chǔ)電極之間傳遞電子的途徑，因而擴(kuò)散步驟的影響減小，從而表現(xiàn)為二者混合控制的電極反應(yīng)機(jī)理。這與納米鉑顆粒摻雜的生物傳感器電子傳遞過(guò)程類(lèi)似[14]。

3 結(jié)論

利用環(huán)糊精-預(yù)聚環(huán)糊精的混合溶液作分散劑來(lái)分散CNT，通過(guò)預(yù)聚環(huán)糊精的聚合反應(yīng)制備出不溶于水的CDP-CNT復(fù)合膜，以其作為載體固定乙酰膽堿酯酶，得到了一種靈敏度較高、檢測(cè)范圍較寬的有機(jī)磷農(nóng)藥生物傳感器。該傳感器可以在 1.0～15.0 mg/L濃度范圍內(nèi)檢測(cè)農(nóng)藥甲胺磷的含量，檢測(cè)下限為0.05 mg/L。文中還探討了該傳感器的電極反應(yīng)機(jī)理，表明電極的電子傳遞過(guò)程受電子轉(zhuǎn)移步驟和擴(kuò)散控制步驟兩者共同作用。

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