于寒松，張繼星，李彥舫，馬蘭青*，胡耀輝,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028043；3.吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062；4.農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點開放實驗室，北京農(nóng)學(xué)院，北京 102206)

高山紅景天中糖基轉(zhuǎn)移酶家族cDNA全長基因的克隆

于寒松1，張繼星2，李彥舫3，馬蘭青4,*，胡耀輝1,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028043；3.吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062；4.農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點開放實驗室，北京農(nóng)學(xué)院，北京 102206)

為了獲得高山紅景天中紅景天苷生物合成關(guān)鍵酶——UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶家族基因的全長cDNA序列，采用在線簡并引物設(shè)計軟件結(jié)合3′-RACE技術(shù)獲得兩個糖基轉(zhuǎn)移酶基因的3′端部分序列，進(jìn)一步采用不同的5′-RACE試劑盒擴(kuò)增兩個基因的5′端序列，結(jié)果顯示利用Takara公司的試劑盒擴(kuò)增可以得到cDNA全長序列(GenBank登錄號為EF508689和EU567325)，而采用Invitrogen公司的試劑盒得到的序列不包括全部開放讀碼框。實驗證明，利用Takara公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit克隆獲得基因全長序列的比率更高。

糖基轉(zhuǎn)移酶；基因克隆；cDNA末端快速克隆法(RACE)；高山紅景天

Abstract：In order to obtain the critical enzyme for the synthesis ofRhodiola sachalinensisglycoside, two putative UDP-glycosyltransferase (UGT) cDNAs (GenBank accession number, EF508689和EU567325) were isolated fromR. sachalinensi.The primers were designed for 3＇-rapid amplification of cDNA ends (RACE) based on the consensus hybrid oligonucleotide primers (CODEHOP) strategy by the Block Maker program. A full-length cDNA sequence (Genbank accession numbers:EF508689 and EU567325) was obtained through the amplification using a SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit (TaKaRa,Dalian, China), whereas the sequence obtained using a 5'-RACE system (version 2.0, InvitrogenTMLife Technologies) contained no full-open reading frame.The cloning efficient of two 5'-RACE systems was investigated. Results exhibited that TaKaRa SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit was more efficient in complete cDNA sequence cloning, compared with the InvitrogenTM5'-RACE system.

Key words：glycosyltransferase；gene cloning；rapid amplification of cDNA ends (RACE)；Rhodiola sachalinensis

植物次生代謝物質(zhì)在植物生命活動過程中起著重要作用，如細(xì)胞解毒、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、防御機(jī)制等[1-3]。對人類而言，很多植物次生代謝物具有很多生理功能，也是保健品和醫(yī)藥品的重要來源[4]?，F(xiàn)階段天然產(chǎn)物己越來越多地被應(yīng)用于保健食品、天然香料、天然色素和藥物等產(chǎn)品的生產(chǎn)上[5-6]。但是，植物雖然能合成上萬種次生代謝產(chǎn)物，但是它們的含量都很低。因此，利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)獲得有價值的次生代謝產(chǎn)物已成為科學(xué)家研究的熱點。

長白山高山紅景天具有明顯的抗輻射、抗疲勞、抗病毒、延緩機(jī)體衰老等生理功能[7-10]，主要是由于它含有紅景天苷、酪薩維、紅景天素和草質(zhì)素苷等多種糖苷，這些物質(zhì)都是糖基轉(zhuǎn)移酶的催化產(chǎn)物[11-12]，尤其是紅景天的主要功能性物質(zhì)——紅景天苷，就是在酪醇糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下合成的。因此，以長白山高山紅景天為原料，克隆糖基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)w外合成紅景天的功能性物質(zhì)或上調(diào)紅景天合成這些次生代謝物質(zhì)的量具有重要意義。本實驗以長白山高山紅景天為原料，通過基因工程方法分離糖基轉(zhuǎn)移酶家族的基因，同時比較兩種5′-RACE試劑盒克隆未知基因5′端序列的效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高山紅景天野生植株采自吉林長白山。

SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit 日本Takara公司；5'RACE system for rapid amplification of cDNA ends試劑盒 美國Invitrogen公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司和上海華大鼎安公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

Biometra 2000 PCR擴(kuò)增儀 德國Whatman Biometra公司；MIKRO 22R高速冷凍離心機(jī) Hettich公司；－80℃超低溫冰箱 Sanyo公司；電泳儀 北京六一儀器公司；TGL 16G高速臺式離心機(jī) 上海醫(yī)用分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 高山紅景天總RNA提取

采用改進(jìn)后的CTAB-LiCl法提取總RNA，具體步驟參照文獻(xiàn)[13]。

1.3.2 引物設(shè)計

1.3.2.1 3′-RACE簡并引物設(shè)計

上游引物設(shè)計：根據(jù)在GenBank上已發(fā)布的植物糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列及相關(guān)文獻(xiàn)[14-15]，選取其中5個以簡單酚類為催化底物的酶序列，其中包括藏紅花 (登錄號AY262037)、甜菊(登錄號AY345982)、擬南芥(登錄號AC002333)、煙草屬(登錄號AB052558)、甘草屬(登錄號AB098614)。將這些序列以FASTA格式提交到http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/blockmkr/www/make_blocks.html得到5個酶的氨基酸保守區(qū)序列，將最保守的序列提交到在線引物設(shè)計軟件CODEHOP (http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html) 中進(jìn)行引物設(shè)計，得到的引物命名為引物B，序列為5′-GTT GGAGTTTTTGTTACTCAytgyggntgga-3′。

下游引物設(shè)計：根據(jù)反轉(zhuǎn)錄的引物Q1：5′-GAG GACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTT-3′設(shè)計下游引物序列為Q2：5′-GAGGACTCGAGCTCAAGC-3′。

1.3.2.2 5′-RACE特異性引物設(shè)計

根據(jù)獲得的兩個糖基轉(zhuǎn)移酶基因的3′端序列利用Primer Primer 5.0軟件分別設(shè)計5'-RACE實驗巢式引物，引物序列見表1。

表1 克隆UGTC和UGTR5＇端引物序列Table 1 Primer sequences for cloning 5＇-end ofUGTCandUGTR

其他5′-RACE所需相關(guān)引物CDS Prime、SMART II、UPM引物為SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit自帶引物；AAP、UAP、AUAP引物為5＇-RACE system for rapid amplification of cDNA ends試劑盒自帶引物。

1.3.3 PCR擴(kuò)增條件

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行3＇-RACE實驗，PCR條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃ 30s，58℃45s，72℃ 1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。5＇-RACE的PCR條件按照相應(yīng)的試劑盒說明書操作。

目的基因的回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定均按常規(guī)方法[16]操作，序列測定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

應(yīng)用NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站上的BLAST程序完成氨基酸序列比對和蛋白質(zhì)序列同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3′-RACE實驗結(jié)果

以提取的紅景天總RNA為模板，利用引物Q1進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用引物Q2和B進(jìn)行PCR，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示3′-RACE實驗獲得兩個約500bp的基因片段，見圖1。所得片段與pMD18-Tsimple載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后送測序公司測序。

圖1 3＇RACE實驗結(jié)果Fig.1 Results of 3＇-RACE

2.2 5′-RACE實驗結(jié)果

根據(jù)3′-RACE實驗所得到的序列設(shè)計5′-RACE實驗所需的特異性引物(表1)，參照試劑盒說明書進(jìn)行5′-RACE實驗，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示：采用Invitrogen公司試劑盒擴(kuò)增得到的基因片段長度都為800bp左右，見圖2、3；而采用Takara公司試劑盒擴(kuò)增得到的基因片段長度在1100bp左右，見圖4、5。將所得到的基因序列與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后測序。

圖2 Invitrogen試劑盒UGTC5＇-RACE結(jié)果Fig.2 Analytical results of 5＇-RACE ofUGTCgene by Invitrogen kit

圖3 Invitrogen試劑盒UGTR5＇-RACE結(jié)果Fig.3 Analytical results of 5＇-RACE ofUGTRgene by Invitrogen kit

圖4 Takara試劑盒UGTC5＇-RACE結(jié)果Fig.4 Analytical results of 5＇-RACE ofUGTCgene by Takara kit

圖5 Takara試劑盒UGTR5＇-RACE結(jié)果Fig.5 Analytical results of 5＇-RACE ofUGTRgene by Takara kit

測序結(jié)果顯示，兩個試劑盒擴(kuò)增的兩個酶5′端基因片段都分別都有800個左右堿基序列完全相同，但Takara公司試劑盒擴(kuò)增得到的基因序列比Invitrogen公司試劑盒擴(kuò)增產(chǎn)物長200個堿基左右，經(jīng)過生物信息學(xué)分析，Takara公司試劑盒擴(kuò)增得到的序列包括完整的開放讀碼框序列，并且分別含有41個和53個堿基的上游非編碼序列。說明利用Invitrogen公司試劑盒擴(kuò)增沒有得到基因的全部編碼序列，而利用Takara公司試劑盒擴(kuò)增可以得到包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)的全部酶基因序列。全序列的序列信息已登陸到GenBank，登錄號分別為EF508689和EU567325。

2.3 兩個新基因的生物信息學(xué)分析

將兩個新的基因序列翻譯成氨基酸并應(yīng)用NCBI的BLAST程序進(jìn)行分析，分析結(jié)果如圖6、7所示?？梢钥闯鰞蓚€基因都屬于糖基轉(zhuǎn)移酶超家族。UGTC翻譯蛋白具有PLN02152型結(jié)構(gòu)域，代表UGTC可能屬于UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶類；UGTR翻譯蛋白具有PLN02992型結(jié)構(gòu)域，代表UGTR可能屬于松柏醇葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶類。

圖6 UGTC蛋白的結(jié)構(gòu)功能域分析Fig.6 Analysis of structure and function domains in UGTC protein

圖7 UGTR蛋白的結(jié)構(gòu)功能域分析Fig.7 Analysis of structure and function domains in UGTR protein

3 討 論

紅景天苷生物合成最后一步反應(yīng)機(jī)制已經(jīng)清楚，植物體內(nèi)的尿苷二磷酸(UDP-glucosyltransferase，UDPGT)以尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和酪醇為底物催化合成紅景天苷[17]。因此，提高這個關(guān)鍵酶表達(dá)量很有可能提高植物或植物細(xì)胞內(nèi)紅景天苷的含量。因此，克隆高山紅景天中的糖基轉(zhuǎn)移酶對在分子水平上調(diào)控紅景天苷的合成具有非常重要的意義。

在線簡并引物設(shè)計程序CODEHOP與Takara公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit聯(lián)合使用，對于獲得未知基因的cDNA全長序列的效率較高，為新基因分離提供了一條新的快捷途徑。

CODEHOP在線設(shè)計的簡并引物與傳統(tǒng)引物設(shè)計方法所得引物相比具有擴(kuò)增特異性高和靈敏度高的優(yōu)點，原理在于用CODEHOP設(shè)計的引物包括兩部分：一部分是根據(jù)保守氨基酸序列設(shè)計的3′簡并區(qū)，一部分是根據(jù)保守氨基酸和密碼子偏好性原則預(yù)測的最有可能的5′特異夾板區(qū)[13,18]。

由于cDNA 5＇端的序列各不相同，如何利用已知片斷序列得到全長的cDNA，是一個令人困擾的問題。常見的做法是利用末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈cDNA的3＇末端加上一連串的G或者C，再通過補(bǔ)齊黏末端，利用已知的兩頭序列進(jìn)行擴(kuò)增(Invitrogen試劑盒原理)，但這種方法存在一些問題，如接頭的連接效率較低，且這些方法需要多次用不同的酶處理有限的樣品，并經(jīng)過反復(fù)的純化，對于少量樣品中的低豐度信息，很大程度上會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外由于mRNA容易部分降解，很難確保得到的cDNA是全長的cDNA。而Takara試劑盒中應(yīng)用的逆轉(zhuǎn)錄酶在以mRNA為模板合成cDNA的時候，當(dāng)?shù)竭_(dá)mRNA的5＇末端碰到真核mRNA特有的“帽子結(jié)構(gòu)”時，即甲基化的G時會連續(xù)在合成的cDNA末端合成幾個C，由于有5＇“帽子結(jié)構(gòu)”的mRNA才能利用這個逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到能擴(kuò)增的cDNA，因此被轉(zhuǎn)錄的都是沒有降解的RNA，擴(kuò)增得到的cDNA就都是全長cDNA。

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Full-length cDNA Cloning of Glycosyltransferase Family fromRhodiola sachalinensis

YU Han-song1，ZHANG Ji-xing2，LI Yan-fang3，MA Lan-qing4,*，HU Yao-hui1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China；2. College of Life Sciences, Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao 028043, China；3. College of Plant Science, Jilin University, Changchun 130062, China；4. Key Laboratory of Urban Agriculture(North), Ministry of Agriculture, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China)

Q785

A

1002-6630(2010)21-0244-04

2010-06-30

國家自然科學(xué)基金項目(30900112)

于寒松(1979—)，男，講師，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：yuhansong@jluhp.edu.cn

*通信作者：馬蘭青 (1971—), 男，副教授，博士，研究方向為植物次生代謝分子調(diào)控與代謝工程。E-mail：lqma@bac.edu.cn

胡耀輝(1951—)，男，教授，學(xué)士，研究方向為食品生物制造與新資源利用。E-mail：huyaohui@vip.163.com