佟雪紅, 徐世宏 劉清華 李 軍 肖志忠 馬道遠

(1. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院 研究生院, 北京 100039)

條斑星鰈幼魚變態(tài)期間核酸及蛋白的變化

佟雪紅1,2, 徐世宏1, 劉清華1, 李 軍1, 肖志忠1, 馬道遠1

(1. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院 研究生院, 北京 100039)

本試驗測定了條斑星鰈(Verasper moseri)幼魚變態(tài)過程中DNA、RNA、蛋白及其比值的變化, 作為評價幼魚變態(tài)階段生長潛能的指標。結(jié)果表明, 試驗期間培育水溫為16.5~18.0°C, DNA、RNA及蛋白的變化都帶有發(fā)育階段特異性。DNA含量在34~42日齡增加緩慢, 然后快速增加直至 44日齡, 在45日齡和46日齡分別保持下降和上升趨勢。蛋白含量和RNA含量的變化趨勢相似, 在試驗期間保持快速增長的趨勢。RNA/DNA比值從試驗開始至35日齡呈上升狀態(tài), 36日齡時下降, 38日齡時達到最高值5.01, 然后顯著下降(P<0.05), 在試驗結(jié)束時達到最低值1.76。蛋白/DNA在40日齡時達到最高值58.64, 在 46日齡時達到最低值 21.28。RNA、DNA及蛋白含量跟全長和體質(zhì)量有明顯的線性關系(P<0.05)。RNA/DNA與全長和體質(zhì)量的關系比蛋白/DNA與全長和體質(zhì)量的關系密切。蛋白/DNA比值的變化趨勢跟 RNA/DNA比值類似, 但前者的變化滯后于后者, 表明 RNA/DNA比值是評價條斑星鰈生理狀況的更有效的生理指標。

條斑星鰈(Verasper moseri); 幼魚; DNA; RNA; 蛋白

魚類在仔稚魚階段對外界環(huán)境的變化很敏感,此階段以快速的生長率和劇烈的形態(tài)改變?yōu)闃酥綶1~3]。魚類的生長可以通過體長或者體質(zhì)量來度量,而后者的變化可以體現(xiàn)在仔稚魚核酸和蛋白組成的變化方面[3]。由于仔魚的形體較小, 精確測定仔稚魚形態(tài)指標比較困難, 因此傳統(tǒng)的通過體長或者體質(zhì)量衡量成魚生長的方法并不適用于仔稚魚[4,5], 加之有些魚類在仔魚階段生長緩慢, 降低了應用體長或體質(zhì)量來評價生長的可行性[6]。所以, 借助于生化指標來度量魚類的生長是非常必要的。

近年來, 利用形態(tài)學、組織學及生化分析等方法評價養(yǎng)殖和野生魚類仔稚魚階段生理狀況的研究逐漸開展[7~9]。在通過傳統(tǒng)方法不能度量出魚類生長的變化時, 生化指標能夠準確地檢測到魚類生長的細微變化和食物分布的波動[10]。最近, 仔稚魚的生長潛能多采用以核酸為基礎的指標(例如: RNA/DNA)進行度量, RNA/DNA比值反映了魚類蛋白的合成能力[11~16]。采用以核酸為基礎的指標來評價生長的基礎在于動物細胞中DNA的量是恒定的, RNA的量跟蛋白合成的速度緊密相連[2]。由于仔魚的生長依賴于蛋白的合成, 而且以核酸為基礎的參數(shù)對仔稚魚的攝食變化反映靈敏, 因此以核酸為基礎的指標是評價仔稚魚生長的有效參數(shù)[17~19]。國內(nèi), 趙玲等[20]對鰱(Hypophthalmichehys molitrix)、鳙(Aristichthys nobilis)、團頭魴(Megalobrama amblycephala)的研究,羅莉等[21]對草魚(Ctenopharyngodon idellus)的研究以及梁萌青等[22]鲀對紅鰭東方 (Takifugu rubripes)的研究均表明, RNA/DNA 比值是一個非常靈敏地反映魚類生長的指標。另外, RNA/DNA 比值還可以推斷天然水域中魚類幼體的營養(yǎng)狀況以及是否處于饑餓狀態(tài)[23]。RNA/DNA 比值還被用來作為評價魚用配合飼料優(yōu)劣的指標和衡量水環(huán)境的指標, 能在一定條件下預測污染與否以及水環(huán)境是否有利于魚類的生長[24,25]。因此, RNA/DNA比值在水產(chǎn)動物的生產(chǎn)和研究中是一個非常重要的指標。

條斑星鰈(Verasper moseri)俗稱“花豹子”、“花邊爪”, 屬鰈形目(Pleuronectiformes)、鰈科(Pleuronectidae)、星鰈屬(Verasper), 主要分布于日本茨城縣以北到鄂霍茨克海以南海域, 中國黃渤海海域亦有少量分布, 為冷溫性大型底棲魚類。變態(tài)期往往伴隨著營養(yǎng)危機和高的死亡率, 是鲆鰈魚類早期發(fā)育階段的關鍵期, 并決定著年產(chǎn)量和經(jīng)濟收益[26~28]。因此, 評價此階段仔稚魚的生理狀況和生長潛能是非常必要的。本試驗的目的在于探索條斑星鰈變態(tài)階段核酸和總蛋白的變化規(guī)律, 明確生化指標跟生長的相關關系, 從而建立生化指標評價仔稚魚生理狀況的檢測技術。

1 材料和方法

1.1 仔稚魚的培育

實驗所用條斑星鰈魚苗取自山東煙臺東方海洋科技股份有限公司。樣品為孵化后 34~46日齡的魚苗。仔稚魚在16 m3的水泥池中流水培育, 培育時的水質(zhì)條件是: 水溫為 16.5~18.0 °C, 溶氧為 7.0~8.5 mg/L, 鹽度為30~32, pH為7.7~8.0。試驗期間投喂人工配合餌料。

1.2 樣品采集和保存

試驗自魚苗孵化后34 d開始至46 d結(jié)束。2 d取樣1次, 8: 00定點取樣45尾, 其中15尾先用丁香酚麻醉, 再用冰冷的去離子水沖洗并快速凍于液氮中保存, 用于測定 RNA、DNA及蛋白。其余的 30尾用于測定全長、體長及體質(zhì)量。

1.3 核酸及蛋白的測定

參照Buckley[29]和Kuropat等[30]的方法, 采用整體勻漿法提取條斑星鰈仔稚魚的核酸和蛋白。用GeneQuantpro紫外分光光度計測定各自的 A260值,并計算RNA 和DNA 的含量。依據(jù)Bradford[31]的方法測定蛋白。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗所得數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差。采用SPSS 11.0 for Windows統(tǒng)計軟件中 One-way ANOVA分別分析核酸及蛋白在不同生長時期的差異顯著性, 當P<0.05時認為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 條斑星鰈的生長變化

條斑星鰈變態(tài)期間體長和體質(zhì)量的變化見圖1。魚苗34日齡時開始變態(tài), 44日齡時變態(tài)結(jié)束。變態(tài)開始時體質(zhì)量和體長分別是23.5mg、1.1cm。體質(zhì)量的增長程度高于體長的增長程度。變態(tài)高峰期時, 體長和體質(zhì)量增長迅速; 變態(tài)結(jié)束時, 體長和體質(zhì)量的增長速度變慢。

2.2 核酸及蛋白的變化

本論文采用兩種單位(質(zhì)量比和含量)分別來闡述 DNA、RNA及蛋白的變化規(guī)律。質(zhì)量比表示為μg/mg 濕質(zhì)量, 指的是每毫克體質(zhì)量下DNA、RNA及蛋白的量; 含量表示為μg/尾, 指的是每尾魚所具有的DNA、RNA及蛋白的量。

圖1 條斑星鰈仔稚魚體質(zhì)量和體長的變化Fig. 1 Changes in body weight and body length of barfin flounder larvae and juveniles

圖2 條斑星鰈仔稚魚DNA, RNA和蛋白質(zhì)量比的變化平均值后字母不同者表示差異顯著, 圖3、圖4同F(xiàn)ig. 2 Changes in DNA, RNA and protein concentrations of barfin flounder larvae and juvenilesMeans followed by different letters are significantly different

DNA質(zhì)量比在32至42日齡期間保持恒定, 在44日齡時顯著上升(P<0.05), 然后呈下降趨勢, 在46日齡時數(shù)值升至最高(圖2)。RNA質(zhì)量比從實驗開始至變態(tài)高峰期增長快速, 之后逐漸下降。蛋白質(zhì)量比在40日齡之前保持波動狀態(tài), 然后維持在較高的穩(wěn)定水平。

DNA、RNA及蛋白含量在試驗期間均保持快速增長的趨勢, 在 40~44日齡期間增加顯著(P<0.05),但在45日齡時緩慢下降(圖3)。

圖3 條斑星鰈仔稚魚DNA, RNA和蛋白含量的變化Fig. 3 Changes in DNA, RNA and protein contents of barfin flounder larvae and juvenilesMeans followed by different letters are significantly different

2.3 RNA/DNA和蛋白/DNA的變化

RNA/DNA比值在試驗期間保持波動趨勢(圖4),試驗開始至35日齡該比值呈上升狀態(tài), 36日齡時下降, 在 38日齡時達到最高值 5.01, 然后顯著下降(P<0.05), 在試驗結(jié)束時達到最低值1.76。蛋白/DNA變化趨勢跟RNA/DNA變化趨勢類似, 在40日齡時達到最高值58.64, 在試驗結(jié)束時達到最低值21.28。

圖4 條斑星鰈仔稚魚蛋白/DNA和RNA/DNA的變化Fig. 4 Changes in protein/DNA and RNA/DNA ratios of barfin flounder larvae and juvenilesMeans followed by different letters are significantly different

2.4 DNA、RNA、蛋白及其比值與全長和體質(zhì)量的關系

本實驗中, 以核酸為基礎的指標與全長和體質(zhì)量的關系見圖5和表1。DNA、RNA及蛋白含量跟全長有明顯的線性關系,R2分別是 0.772、0.921、0.906 (P<0.05)。DNA、RNA及蛋白含量跟體質(zhì)量也有明顯的線性關系,R2分別是 0.851、0.987、0.985(P<0.05)。RNA/DNA與全長和體質(zhì)量的線性關系R2分別是0.465、0.531; 蛋白/DNA與全長和體質(zhì)量的線性關系R2分別是0.337、0.377; RNA/DNA與全長和體質(zhì)量的關系比蛋白/DNA與全長和體質(zhì)量的關系密切。蛋白增長率與全長和體質(zhì)量無明顯的線性關系,R2分別為0.06、0.025。

表1 蛋白含量、以核酸為基礎的指標及蛋白增長率與條斑星鰈仔稚魚全長和體質(zhì)量的回歸關系Tab. 1 Regression equations of protein, the nucleic acids-based indices or Gpi with total length and body weight of barfin flounder larvae and juveniles

3 討論

3.1 條斑星鰈變態(tài)期間核酸及蛋白的變化

核酸在魚類的生長和發(fā)育過程中起著重要作用。DNA的量反映了魚體的細胞數(shù)量, 而RNA的量則跟細胞中蛋白的合成直接相關[2]。本試驗中, RNA質(zhì)量比在 38日齡之前呈上升趨勢, 然后下降, 而DNA質(zhì)量比在此期間幾乎沒有變化, 表明從變態(tài)開始至變態(tài)高峰期, 條斑星鰈的生長以細胞增大為主;魚類變態(tài)是一個耗能的過程, 所以, 變態(tài)后期 RNA量會降低[27]。RNA和蛋白含量在條斑星鰈變態(tài)期間呈快速增長的趨勢, 這可能與鲆鰈類變態(tài)期間內(nèi)臟器官的發(fā)育和完善密切相關[2,32]。本實驗中蛋白含量的變化趨勢跟RNA含量的變化趨勢類似, 說明RNA含量變化反映了魚體蛋白合成的多少。

圖5 條斑星鰈仔稚魚全長和體質(zhì)量與蛋白、RNA、DNA、RNA/DNA、Gpi及蛋白/DNA的關系Fig. 5 Relationships of protein, RNA, DNA, RNA/DNA, Gpi or protein/DNA with total length and body weight of barfin flounder larvae and juveniles

DNA含量是生物體內(nèi)細胞數(shù)目的指示因子[32]。42日齡時 DNA含量的急劇增長可能預示了此時條斑星鰈魚苗比較脆弱[33], 對外界反映很敏感, 該時期條斑星鰈正經(jīng)歷由浮游狀態(tài)到底棲狀態(tài)的改變。本實驗中以核酸為基礎的指標從細胞水平上反映了條斑星鰈的生長特性: 條斑星鰈變態(tài)期間的生長以細胞增大為主, 而在變態(tài)后的生長以細胞增殖為主。與在牙鲆中得出的試驗結(jié)果類似[1], 本試驗中 DNA和RNA含量的變化跟發(fā)育階段和仔稚魚大小密切相關。另外, 鲆鰈類變態(tài)期間, 內(nèi)在器官經(jīng)歷分化和成熟的過程[34], 因此, 本試驗中RNA和DNA含量的變化跟此發(fā)育階段器官的分化增殖也有一定聯(lián)系。

3.2 條斑星鰈變態(tài)期間 RNA/DNA比值的變化

RNA/DNA是生物體中細胞代謝強度的指示指標, 因此常被用來評價魚類的生理狀況[35]。本實驗中RNA/DNA呈波動性變化, 主要是由于 RNA含量波動和DNA含量相對穩(wěn)定的緣故。該比值在36日齡時急劇下降, 原因在于此時 RNA量的下降和 DNA量的增長, 由此進一步說明此時細胞增殖的速度要高于蛋白合成的速度[1]。在38日齡時, RNA/DNA比值上升至最高峰, 表明此時蛋白合成的速度快于細胞增殖的速度, 合成的蛋白可能跟變態(tài)高峰時器官的分化增殖有關。RNA/DNA比值在變態(tài)后顯著下降,表明細胞中蛋白合成的降低和細胞數(shù)目的增多, 這可能跟此時期條斑星鰈稚魚生長方式由浮游狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榈讞钏殡S的能量消耗有關。本研究中,RNA/DNA比值隨魚體增大呈下降趨勢, Kimura等[35]在評價日本沙丁魚初次攝食時的營養(yǎng)狀況時, 以及Clemmesen[36]在分析餌料分布對青魚 RNA/DNA 比值的影響時, 均得出了類似結(jié)果。

對牙鲆進行的相關研究顯示, RNA/DNA有一個關鍵的臨界值為2.49[1,37], RNA/DNA低于此臨界值的牙鲆仔稚魚處于“亞健康”狀態(tài)或者饑餓狀態(tài)。本研究中, 條斑星鰈從38日齡開始RNA/DNA比值急劇下降, 而且在44日齡后該比值均維持在2左右,這可以從條斑星鰈生活習性的改變上得到解釋, 條斑星鰈變態(tài)后將由浮游生活轉(zhuǎn)為伏底生活, 棲息環(huán)境的轉(zhuǎn)變可能會影響條斑星鰈的攝食并進一步導致生理狀況和營養(yǎng)水平的急劇變化, 從而使得 RNA/DNA下降至臨界值周圍。因此, 剛伏底的一段時間往往是條斑星鰈的死亡高發(fā)期。

3.3 條斑星鰈變態(tài)期間蛋白/DNA比值的變化

蛋白/DNA是生物體中細胞大小或者細胞質(zhì)量的指標, 因為蛋白占據(jù)了細胞的絕大部分質(zhì)量[32]。38日齡時蛋白/DNA比值明顯下降, 主要是由于變態(tài)高峰期時的巨大能量消耗和器官分化所需要的細胞快速增殖所致。而在40日齡該比值達到最高峰, 原因在于生物體快速合成了大量蛋白以應對伏底期的營養(yǎng)危機。條斑星鰈轉(zhuǎn)入伏底后, 生物體將大量耗能,表現(xiàn)為蛋白/DNA比值的急劇下降。Fukuda等[32]發(fā)現(xiàn), 施氏鰈(Pleuronectes schrenki)在變態(tài)后蛋白/DNA比值也呈下降趨勢。蛋白/DNA跟RNA/DNA的變化趨勢相似, 但在時間上相對滯后, 說明RNA/DNA是評價條斑星鰈生理狀況和生長的更有效的指標。

以上結(jié)果表明, 條斑星鰈變態(tài)期間的生長以細胞增大為主, 而在變態(tài)后的生長以細胞增殖為主,以核酸為基礎的指標可以從細胞水平上評價條斑星鰈仔稚魚的生長。

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Changes in nucleic acids and protein indices during metamorphosis of barfin flounder Verasper moseri

TONG Xue-hong1,2, XU Shi-hong1, LIU Qing-hua1, LI Jun1, XIAO Zhi-zhong1,MA Dao-yuan1
(1. Institute of Oceanology, the Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China ; 2. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China)

Mar., 15, 2010

barfin flounder (Verasper moseri); juvenile ; DNA ; RNA ; protein

Changes in DNA, RNA, protein and their ratios of barfin flounder Verasper moseri during metamorphosis were determined, and were used to evaluate the growth potential of barfin flounder at this stage. Water temperature fluctuated between 16.5°C and 18.0°C. Patterns of DNA, RNA and protein parameters all showed developmental stages-specific traits. DNA content remained slight increase until 42 days after hatching (DAH) and showed abrupt rise towards 44 DAH followed by a drop and a rise around 45 and 46 DAH, respectively. The changes in protein content coincided well with those of RNA content; and they both kept obvious increases throughout the experimental period. RNA/DNA ratio increased up to 35 DAH, but decreased at 36 DAH, and reached the climax of 5.01 at 38 DAH, which was followed by a significant decline with the minimum value of 1.76 at the end of the experiment. Protein/DNA reached the maximum value of 58.64 at 40 DAH and the minimum value of 21.28 at 46 DAH. DNA, RNA and protein contents all showed significant correlations with total length and body weight of barfin flounder (P<0.05). RNA/DNA had stronger correlations with total length and body weight of barfin flounder than protein/DNA. Protein/DNA showed a similar pattern to RNA/DNA, but the changes in protein/DNA lagged behind those in RNA/DNA, suggesting that RNA/DNA ratio is a more sensitive index than protein/DNA ratio in evaluating physiological conditions of barfin flounder.

Q955

A

1000-3096(2010)05-0041-07

2010-03-15;

2010-03-23

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金資助項目(nycytx-50);國家863“十一五”計劃資助項目(2006AA10A404)

佟雪紅(1979-), 女, 山東濰坊人, 博士研究生, 研究方向:海洋生物學, 電話: 0532-82898716, E-mail: txh113005@163.com; 李軍,通信作者, 研究員, E-mail: junli@ms.qdio.ac.cn

(本文編輯: 譚雪靜)