周亞維, 焉婷婷, 李朋富, 劉志禮

(南京大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇 南京 210093)

鹽度脅迫下鹽生隱桿藻抗氧化防御系統(tǒng)的變化

周亞維, 焉婷婷, 李朋富, 劉志禮

(南京大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇 南京 210093)

鹽生隱桿藻(Aphanothece halophytica)是在飽和 NaCl條件下可以生存的少數(shù)幾種耐鹽藍(lán)藻之一,作者研究了鹽脅迫對(duì)鹽生隱桿藻細(xì)胞內(nèi)丙二醛含量、2種非酶抗氧化劑含量以及4種抗氧化酶活性的影響。與對(duì)照組相比, 低鹽脅迫和高鹽脅迫都抑制鹽生隱桿藻的生長(zhǎng)。隨著鹽度脅迫程度的增加, 丙二醛含量、非酶抗氧化劑含量和抗氧化酶(除了過(guò)氧化氫酶)活性不斷增強(qiáng)。上述結(jié)果表明： 鹽脅迫下,鹽生隱桿藻細(xì)胞內(nèi)非酶抗氧化劑和抗氧化物酶水平的增加可以應(yīng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)升高的氧化傷害, 抗氧化防御系統(tǒng)可能在鹽生隱桿藻對(duì)鹽脅迫的耐受機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。

鹽生隱桿藻(Aphanothece halophytica); 丙二醛; 抗氧化酶; 非酶抗氧化劑; 鹽度脅迫

鹽度脅迫以及其他環(huán)境因子如重金屬、極端溫度和強(qiáng)輻射等可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子、過(guò)氧化氫、羥基自由基等活性氧自由基(ROS)的產(chǎn)生[1], ROS通過(guò)對(duì)膜脂、核酸和蛋白的氧化傷害干擾正常的細(xì)胞代謝[2]。植物、藻類(lèi)及其他生物, 可以通過(guò)增強(qiáng)酶或非酶抗氧化系統(tǒng)清除氧化脅迫下細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS[3]。

參與抗氧化的酶系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽氧化酶、過(guò)氧化物酶[3], 以及參與抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)的抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、脫氫抗壞血酸還原酶、單脫氫抗壞血酸還原酶以及谷胱甘肽還原酶(GR)[4]。非酶抗氧化劑包括類(lèi)胡蘿卜素、抗壞血酸(ASA)、還原型谷胱甘肽(GSH)和生育酚等[4]。研究發(fā)現(xiàn), 一些高等植物對(duì)鹽度脅迫的耐受性與其抗氧化系統(tǒng)清除 ROS的能力呈正相關(guān), 鹽度脅迫導(dǎo)致氧化脅迫, 對(duì)氧化脅迫耐受性的增強(qiáng)是其耐鹽性提高的原因之一[5～7]。鹽度脅迫條件下, 耐鹽小麥(Triticum aestivum L.)與鹽敏感型小麥相比, 細(xì)胞內(nèi)的 H2O2和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物含量更低, 而SOD、APX和GR酶活性則相對(duì)較高[8]。同樣, 鹽度脅迫條件下耐鹽型豌豆(Pisum sativum L.)品種也表現(xiàn)出比鹽敏感型品種具有更高活性的APX、GR、SOD和單脫氫抗壞血酸還原酶[9]。與有關(guān)高等植物的研究相比, 關(guān)于鹽度脅迫下藻細(xì)胞中抗氧化系統(tǒng)變化的研究很少。高鹽脅迫引起耐鹽綠藻杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)細(xì)胞內(nèi)單脫氫抗壞血酸還原酶和抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性明顯升高,而低鹽脅迫引起其GSH和生育酚含量增加、ASA含量下降[10]。海洋綠藻石莼(Ulva fasciata)細(xì)胞中,CAT、GR和GSH活性在低鹽脅迫下增加, 而在高鹽脅迫下SOD、CAT、GR和APX活性升高[11]。

鹽生隱桿藻(Aphanothece halophytica)是在飽和NaCl條件下可以生存的少數(shù)幾種耐鹽藍(lán)藻之一[12]。已有報(bào)道顯示, 鹽生隱桿藻具有特殊的調(diào)節(jié)胞內(nèi)滲透勢(shì)的機(jī)制以適應(yīng)高鹽生境： 一是細(xì)胞內(nèi)積累可溶性有機(jī)溶質(zhì)氨基乙酸甜菜堿[13]; 二是將 Na+輸出細(xì)胞[14]。目前還不清楚鹽生隱桿藻如何調(diào)節(jié)其抗氧化防御系統(tǒng)以適應(yīng)鹽度脅迫環(huán)境。作者通過(guò)分析低鹽脅迫和高鹽脅迫下鹽生隱桿藻抗氧化防御系統(tǒng)的變化, 探討抗氧化防御系統(tǒng)在鹽生隱桿藻耐鹽機(jī)制中可能發(fā)揮的作用。

1 材料和方法

1.1 藻種及其培養(yǎng)條件

鹽生隱桿藻(A. halophytica GR02)系從山東廣饒鹽田分離[15], 使用 Yopp培養(yǎng)基[16], 培養(yǎng)溫度為30 °C± 2 °C, 微量元素為 A5和 B6溶液[17], 光照強(qiáng)度為 3 000 lx± 200 lx, 光暗周期為 12 h：12 h。NaCl的最終濃度分別是0.5、0.65、0.75、1、1.5、2、2.5和3 mol/L。藻細(xì)胞先在各個(gè)鹽度下培養(yǎng)14 d, 再轉(zhuǎn)移至相應(yīng)鹽度的新鮮無(wú)菌培養(yǎng)基(100 mL)中, 初始A750nm為0.1, 每天手動(dòng)搖動(dòng)3次。通過(guò)測(cè)定在750 nm波長(zhǎng)下的A值來(lái)反映藻的生長(zhǎng)狀況, 培養(yǎng)12 d后分別取樣分析抗氧化酶和非酶抗氧化劑含量, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2 脂質(zhì)過(guò)氧化作用的測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化作用通過(guò)測(cè)定丙二醛(MDA)的生成量來(lái)衡量。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液10 mL, 3 000 r/ min

離心5 min, 將藻細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移到2 mL 0.1 %的三氯乙酸溶液中, 然后冰浴超聲(550 Sonic Dismembrator,Fisher Scientific, USA)處理2 min, 進(jìn)一步分析前細(xì)胞勻漿保存在冰浴中。MDA含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸方法[18], 按照丙二醛試劑盒(南京建成生物工程研究所)的使用說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作, 其單位是nmol/ mg蛋白。

1.3 抗氧化酶活性分析

將按照上述方法收集到的藻細(xì)胞重新懸浮于等滲甘油中, 混勻, 0.45 μm 醋酸纖維濾膜過(guò)濾, 將藻細(xì)胞從濾膜上刮下來(lái), 再轉(zhuǎn)移至2 mL的提取液中。提取液為50 mmol/ L pH 7.8的磷酸鉀緩沖液, 其中含 1% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮和 0.2 % (v/v)的 Triton X-100。在測(cè)定APX酶活性時(shí), 提取液pH 7.0的磷酸鉀緩沖液, 其中含0.5 mmol/ L L-ASA)。冰浴中超聲處理2 min后, 勻漿于4 °C條件下12 000 r/ min離心 20 min, 測(cè)定前將得到的上清液置于冰浴中保存。酶活性單位為U/ mg蛋白。

SOD和GR活性的測(cè)定按照南京建成生物工程研究所的試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行。

CAT活性通過(guò)測(cè)定H2O2在240 nm波長(zhǎng)下吸光度值的變化來(lái)計(jì)算, 其消光度值是 39.4 L/(mmol·cm)[19]。反應(yīng)液含有 1.9 mL 50 mmol/L 磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)、1 mL 0.2 % H2O2和0.1 mL 酶提取液。反應(yīng)在加入酶提取液后開(kāi)始。

APX活性通過(guò)測(cè)定ASA在290 nm 處的吸光度值變化值來(lái)計(jì)算, 消光系數(shù)是2. 8 L/(mmol·cm)[20]。3 mL的反應(yīng)液含 50 mmol/ L 磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)、0.5 mmol/L 抗壞血酸、0.1 mmol/ L H2O2、0.1 mmol/ L EDTA和0.1 mL的酶提取液。

1.4 ASA和GSH的含量測(cè)定

藻細(xì)胞收集方法同上。將收集到的藻細(xì)胞重懸于2 mL 5 % 磺基水楊酸中, 冰浴超聲處理2 min。將得到的細(xì)胞勻漿于4°C、12 000 r/ min離心20 min,取上清用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定ASA和GSH含量, 單位是μg/ mg 蛋白。

1.5 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒, 分析方法為考馬斯亮藍(lán)法[23]。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析法(One-Way ANOVA),P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 鹽度脅迫對(duì)生長(zhǎng)的影響

如圖 1所示, 鹽生隱桿藻的最適生長(zhǎng)鹽度為 1 mol/L NaCl, 在實(shí)驗(yàn)中作為對(duì)照。NaCl濃度高于1mol/ L是高鹽脅迫, 低于1mol/ L為低鹽脅迫。

圖1 不同鹽濃度對(duì)鹽生隱桿藻生長(zhǎng)的影響Fig. 1 Effect of different salt concentrations on the growth of A. halophytica

2.2 鹽度脅迫對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

與對(duì)照相比, MDA含量隨著鹽度脅迫程度的增加而升高(圖 2)。低鹽脅迫下, MDA 的含量增加了10 %到95 %(P＜0.05)。在2.5 mol/ L和3 mol/ L NaCl濃度的高鹽脅迫下, MDA含量顯著增加(分別為 45%和 69 %,P＜0.05)。

2.3 鹽度脅迫對(duì)抗氧化酶活性的影響

鹽度脅迫下, 鹽生隱桿藻細(xì)胞內(nèi)SOD酶活性高于對(duì)照組(圖3)。低鹽脅迫下SOD活性提高了37 %到200%; 高鹽脅迫下SOD活性提高了63%到395%(P＜0.05)。

圖2 不同鹽濃度對(duì)鹽生隱桿藻脂質(zhì)過(guò)氧化的影響Fig. 2 Effect of different salt concentrations on lipid peroxidation in A. halophytica相同的字母表示差異不顯著; 不同字母表示差異顯著P ＜0.05; 下同the Same Letter mean no marked differences; Different letters mean significant differences, P ＜ 0. 05

圖3 不同鹽濃度對(duì)鹽生隱桿藻SOD活性的影響Fig. 3 Effects of different salt concentrations on SOD activity in A. halophytica

圖4 不同鹽濃度對(duì)鹽生隱桿藻GR活性的影響Fig. 4 Effects of different salt concentrations on GR activity in A. halophytica

鹽度脅迫導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GR酶活性升高(圖4)。與對(duì)照相比, 0.65 和 0.5 mol/ L NaCl濃度的低鹽脅迫下, GR活性分別增加了64 % 和130 %(P＜0.05); 在高鹽脅迫下, GR酶活性在1.5 mol/ L NaCl濃度下稍有增加(P＞0.05), 在2、2.5 和 3 mol/ L NaCl濃度下分別增加了88 %、214 %和 552 %(P＜0.05)。

鹽度脅迫下細(xì)胞內(nèi) APX活性也增加(圖 5)。低鹽脅迫下, APX活性隨鹽度脅迫程度增加, APX活性增加了16 %到174 % (P＜0.05)。高鹽脅迫下, NaCl濃度為1.5和2 mol/ L時(shí), APX活性稍有增加(P＞0.05), 在2.5 和 3 mol/ L NaCl的更高鹽度下, 其活性分別增加了123 % 和 184 %(P＜0.05)。

圖5 不同鹽濃度對(duì)鹽生隱桿藻APX活性的影響Fig. 5 Effects of different salt concentrations on APX activity in A. halophytica

與前面3種酶的變化不一樣, 鹽脅迫下CAT活性隨著鹽度脅迫程度增加而降低(圖6)。低鹽脅迫下其活性降低了22 %到60 %(P＜0.05); 高鹽脅迫下,在2、2.5和3 mol/ L NaCl濃度下其活性顯著降低, 分別下降了43 %、65 %和52 %(P＜0.05)。

圖6 不同鹽濃度對(duì)鹽生隱桿藻CAT活性的影響Fig. 6 Effects of different salt concentrations on CAT activity in A. halophytica

2.4 鹽脅迫對(duì)ASA和GSH含量的影響

如圖7所示, 隨著低鹽脅迫程度的增加, ASA含量增加了 44 %到 84 %(P＜0.05); 高鹽脅迫下,NaCl濃度為2、2.5 和 3 mol/ L時(shí)其含量顯著增加,分別升高了95 %、131 % 和 256 %(P＜0.05)。

圖7 不同鹽濃度對(duì)鹽生隱桿藻ASA含量的影響Fig. 7 Effects of different salt concentrations on ASA content in A. halophytica

低鹽脅迫下, 隨脅迫程度的增加, GSH含量增加了83 %到136 %(P＜0.05)(圖8)。高鹽脅迫下, GSH含量在2、2.5和3 mol/L NaCl濃度下顯著增加, 分別增加了37 %、60 % 和 134 %(P＜0.05)。

圖8 不同鹽濃度對(duì)鹽生隱桿藻GSH含量的影響Fig. 8 Effects of different salt concentrations on GSH content in A. halophytica

3 討論

0.5 mol/ L NaCl濃度的低鹽脅迫條件下鹽生隱桿藻比高鹽脅迫(2、2.5和3 mol/L NaCl)下生長(zhǎng)得更慢, 而與對(duì)照1 mol/ L NaCl相比, 低鹽脅迫下的鹽濃度變化幅度比高鹽脅迫要小, 這說(shuō)明低鹽脅迫對(duì)鹽生隱桿藻生長(zhǎng)的抑制更加顯著。

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物, 常作為氧化傷害的標(biāo)志物[22]。有報(bào)道指出鹽脅迫能引起高等植物和綠藻細(xì)胞內(nèi) MDA含量的增加[7,11]。本研究中, 鹽生隱桿藻的MDA含量在高鹽和低鹽脅迫下增加, 說(shuō)明細(xì)胞中氧化傷害加劇。如圖2所示, 與1.5～2.5 mol/ L的高鹽脅迫相比, 0.5 mol/ L的低鹽脅迫下鹽生隱桿藻的MDA含量更高, 而與對(duì)照1 mol/ L NaCl相比,1.5～2.5 mol/ L的高鹽脅迫下鹽度的變化幅度大于或等于0.5 mol/ L的低鹽度脅迫, 這說(shuō)明鹽生隱桿藻對(duì)低鹽脅迫更敏感。

SOD是細(xì)胞防御ROS的第一道防線(xiàn), 可以催化O2·-發(fā)生歧化反應(yīng)產(chǎn)生H2O2[1]。在高鹽脅迫和低鹽脅迫下, 鹽生隱桿藻SOD活性都增高, 增高的SOD可以參與消除O2·-。鹽脅迫條件下鹽生隱桿藻SOD活性呈增高趨勢(shì), 這與前人關(guān)于藻類(lèi)的研究結(jié)果不同,而與一些高等植物相似。鹽度脅迫對(duì)耐鹽綠藻杜氏藻的SOD沒(méi)有影響[10], 海洋綠藻石莼在12%和15%NaCl的極度高鹽脅迫下細(xì)胞中SOD的活性增加, 而低鹽脅迫和中度高鹽脅迫下SOD活性變化不大[11]。在高鹽脅迫下, 小麥(Kharchia 65基因型)和棉花(Gossypium herbaceumDhumad)的SOD活性顯著增加[8,23]。

GR間接參與 H2O2清除反應(yīng), 并將氧化性的GSSG轉(zhuǎn)化為 GSH[24]。在高鹽和低鹽脅迫下鹽生隱桿藻細(xì)胞內(nèi)GR活性增高, 這與之前報(bào)道的有關(guān)石莼的研究結(jié)果一致[11], 但不同于杜氏藻, 鹽脅迫對(duì)杜氏藻細(xì)胞中 GR活性沒(méi)有明顯影響[10]。一些高等植物中的研究結(jié)果與鹽生隱桿藻的結(jié)果相似, 如豌豆、棉花以及小麥等在高鹽脅迫下GR活性升高[8,9,23]。

APX和CAT在H2O2清除反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。在A(yíng)SA-GSH循環(huán)中, APX將ASA氧化為單脫氫抗壞血酸, 同時(shí)將H2O2還原為H2O[25]。CAT催化H2O2的歧化反應(yīng)產(chǎn)生H2O和O2[23]。本實(shí)驗(yàn)顯示, 鹽度脅迫下, 鹽生隱桿藻細(xì)胞中 APX活性增加, 而CAT活性下降, 這說(shuō)明 APX在清除 H2O2方面發(fā)揮了主要作用。這不同于在另外兩種藻中的研究報(bào)道：杜氏藻細(xì)胞中APX的活性只在高鹽脅迫下升高, 而鹽度脅迫對(duì)其CAT無(wú)影響[10]; 在低鹽和高鹽脅迫下石莼的CAT活性均增加, 而APX活性?xún)H在高鹽脅迫下增加[11]。與本文研究結(jié)果相似, 一些高等植物如小麥和豌豆的APX 活性在高鹽脅迫下增高[8,9]。

ASA 和 GSH直接參與 O2·-和 OH·等氧化自由基的清除反應(yīng)[26]。ASA 是 APX 的底物, 參與清除H2O2的反應(yīng), 還參與親脂性抗氧化劑 α-生育酚的再生過(guò)程[3]。GSH可以參與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶清除過(guò)氧化物的反應(yīng), 也可以參與谷胱甘肽過(guò)氧化物酶還原脂類(lèi)和烷烴類(lèi)過(guò)氧化物的反應(yīng)[27,28]。鹽度脅迫下鹽生隱桿藻的ASA和GSH含量均增加, 說(shuō)明這兩種抗氧化劑在消除ROS過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。鹽度脅迫下鹽生隱桿藻 ASA和 GSH的變化趨勢(shì)不同于已報(bào)道的另外兩種藻類(lèi)和一些高等植物。石莼的ASA含量在1.5 % NaCl的低鹽度脅迫下增高, 而在高鹽脅迫下減少; GSH含量在低鹽脅迫下增加, 在高鹽脅迫下則沒(méi)有顯著變化[11]。杜氏藻的ASA含量在低鹽脅迫下有小幅度的減少, 而在高鹽脅迫下增加;GSH 在高鹽脅迫下增加[10]。一些高等植物, 如豌豆以及番茄 (Lycopersicon esculentum Mill), 在高鹽脅迫下ASA 和GSH含量減少[9,25]。

本研究結(jié)果顯示, 鹽脅迫導(dǎo)致鹽生隱桿藻細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化傷害。在高鹽和低鹽脅迫下, 抗氧化物酶SOD、GR和APX的活性以及非酶抗氧化劑ASA和GSH的含量的顯著增加可以抵御氧化傷害, 說(shuō)明在藻細(xì)胞的耐鹽機(jī)制中抗氧化防御系統(tǒng)可能發(fā)揮了重要作用。然而, 這些抗氧化物酶和非酶抗氧化劑含量的升高并不能完全抵消鹽脅迫傷害, 同時(shí)也額外消耗了細(xì)胞中的一些能量, 因而與對(duì)照相比, 在鹽脅迫條件下, 藻的生長(zhǎng)仍然受到明顯抑制。

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Changes in antioxidative defense systems of Aphanothece halophytica in response to salt stresses

ZHOU Ya-wei, YAN Ting-ting, LI Peng-fu, LIU Zhi-li
(School of Life Sciences, Nanjing University, Nanjing 210093, China)

Feb., 24, 2010

Aphanothece halophytica;malondialdehyde; antioxidative Enzyme; non-enzymatic antioxidant; salt stress

Aphanothece halophytica is a unique halotolerant cyanobacterium, which can grow even in saturated NaCl. In this study, we investigated the effect of salt stress on the levels of malondialdehyde, two non-enzymatic antioxidants and four antioxidant enzymes in A. halophytica. As compared to control salinity condition, an exposure to hyposaline or hypersaline conditions inhibited the growth of A. halophytica. With the increase of salt stresses,malondialdehyde content, levels of non-enzymatic antioxidants, and antioxidant enzymes increased continuously with the exception of catalase. These results suggest that the levels of non-enzymatic antioxidants and antioxidant enzymes in A. halophytica are increased to counteract the enhanced oxidative stress under salt stresses, and the antioxidant defense system may play an important role in the tolerance mechanism of salt stress.

Q945.78

A

1000-3096(2010)09-0030-06

2010-02-24;

2010-06-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30670400)

周亞維(1983-), 女, 陜西西安人, 碩士, 研究方向： 海洋微藻, 電話(huà)： 025-83686755, E-mail： yaweizhou639@gmail.com; 李朋富,通信作者, 電話(huà)： 025-83686755, E-mail： pengfuli@nju.edu.cn

(本文編輯： 梁德海)