孫 科, 顏 天, 周名江, 何建宗

(1. 中國科學院 海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院研究生院,北京 100039; 3. 香港公開大學 科技學院, 香港 999077)

米氏凱倫藻對褶皺臂尾輪蟲、鹵蟲和黑褐新糠蝦存活的影響

孫 科1,2, 顏 天1, 周名江1, 何建宗3

(1. 中國科學院 海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院研究生院,北京 100039; 3. 香港公開大學 科技學院, 香港 999077)

初步研究了一株米氏凱倫藻對褶皺臂尾輪蟲(Brachionus plicatilis)、鹵蟲(Artemia salina)幼體和黑褐新糠蝦(Neomysis awatschensis)的毒性效應和機制。研究發(fā)現(xiàn)米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)在較低密度下就能明顯減少輪蟲的種群數(shù)量, 24 h EC50僅為20個/mL左右; 該藻的各組分毒性比較結果顯示,只有藻液和細胞重懸液有這種毒害作用, 而去藻過濾液和藻細胞破碎液的影響不明顯, 表明這種毒害作用可能是由于活的藻細胞引起的; 在米氏凱倫藻中鹵蟲和黑褐新糠蝦的存活數(shù)量也明顯下降。結果表明, 米氏凱倫藻赤潮可能通過直接影響存活從而對浮游動物產生影響。

米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi); 褶皺臂尾輪蟲(Brachionus plicatilis); 鹵蟲(Artemia salina);黑褐新糠蝦(Neomysis awatschensis); 種群數(shù)量; 存活

凱倫藻(Karenia sp.)作為一種世界廣布種, 在全球范圍內多個沿海國家形成過赤潮[1], 該藻引發(fā)的魚毒性赤潮常常導致大量魚類和底棲生物的死亡[2～4]。在我國, 凱倫藻赤潮的發(fā)生呈現(xiàn)出由南向北不斷擴大的趨勢[5～7], 其中兩次較為嚴重的凱倫藻赤潮分別發(fā)生在1998年的香港海域和2005年的浙江沿海, 分別給海水養(yǎng)殖業(yè)造成了3.5億元和2000萬元的直接經(jīng)濟損失[7,8]。除能夠對魚類、貝類等較大生物產生危害, 米氏凱倫藻赤潮還能對中華哲水蚤等浮游動物產生不利影響[9]。

海洋浮游動物能夠攝食浮游植物, 又能夠被更高營養(yǎng)級的海洋生物所攝食, 它們在生態(tài)系統(tǒng)中起著承上啟下的重要作用, 可見, 赤潮對浮游動物的影響將會間接擴大為對整個海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響,且赤潮藻能夠通過多種方式與機制對浮游動物造成影響[10]。因此, 開展米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)對海洋浮游動物影響的研究具有重要的意義。輪蟲個體小, 生命周期短, 實驗室易培養(yǎng); 鹵蟲卵可以在實驗室內進行孵化而得到大量的均勻個體, 且它們可以直接濾食和接觸有害藻; 黑褐新糠蝦(Neomysis awatschensis)是廣泛分布于我國沿海的一種小型甲殼生物。近年來, 輪蟲、鹵蟲和黑褐新糠蝦已被廣泛應用于有害赤潮藻的毒性研究中[11～20]。因此, 作者以褶皺臂尾輪蟲(Brachionus plicatilis)、鹵蟲(Artemia salina)幼體、黑褐新糠蝦模擬不同大小的海洋浮游動物, 針對米氏凱倫藻對其種群數(shù)量和存活的影響進行了實驗研究, 并初步分析了米氏凱倫藻赤潮對浮游動物的危害機制。

1 材料與方法

1.1 材料

供試褶皺臂尾輪蟲由中國科學院海洋研究所培養(yǎng)中心提供, 為實驗室常年培養(yǎng)種。實驗用鹵蟲幼體為低溫保藏鹵蟲卵經(jīng)海水孵化得到的無節(jié)幼體(instarⅡ-), Ⅲ鹵蟲卵產自青海尕海湖。黑褐新糠蝦于1995年采集自膠州灣西海岸, 在中國科學院海洋研究所進行了多年多代連續(xù)培養(yǎng)。

實驗所用的米氏凱倫藻分離于南海, 由暨南大學提供。實驗用藻使用3 L錐形瓶以f/2培養(yǎng)液純種培養(yǎng), 培養(yǎng)溫度(20±1), ℃光暗比為14L∶10D。小球藻(Chlorella sp.)由中國科學院海洋研究所藻種中心提供, 以小球藻培養(yǎng)液培養(yǎng), 培養(yǎng)溫度(20±1), ℃光暗比12L∶12D?？肺r實驗海水取自青島膠州灣外太平角無污染海水, 使用前經(jīng)沉淀沙濾, 用于藻類培養(yǎng)與輪蟲、鹵蟲實驗的海水經(jīng) 0.45 μm混合纖維濾膜過濾和高溫滅菌, 鹽度用ATAGO手提式鹽度計測定, 通過加蒸餾水來調節(jié)。

1.2 方法

1.2.1 米氏凱倫藻對輪蟲的影響實驗

輪蟲實驗容器為50 mL燒杯, 實驗體積為30 mL,實驗溫度為(20±1)℃, 實驗中鹽度調節(jié)至31±1。取指數(shù)生長中期的米氏凱倫藻用0.5 mL計數(shù)框計數(shù)后以海水稀釋, 使實驗液藻細胞密度分別達到5、10、20、40、80個/mL, 實驗前輪蟲饑餓12 h, 之后用80 μm篩絹濃縮并以藻培養(yǎng)液和海水稀釋, 使輪蟲最終密度為10個/mL。以投喂小球藻(投喂小球藻終密度約為 104個/mL) 為對照, 另設以消毒海水為實驗液的饑餓組, 每組3個平行, 24 h記錄輪蟲存活數(shù)量。

1.2.2 米氏凱倫藻不同組分對輪蟲的影響實驗

(1)藻培養(yǎng)液： 取指數(shù)生長中期米氏凱倫藻, 用0.5 mL計數(shù)框計數(shù)。(2)藻細胞重懸液：將藻培養(yǎng)液經(jīng)10μm篩絹過濾濃縮后, 用海水將藻細胞重新懸浮。(3)藻培養(yǎng)液過濾液：將(2)中過濾液再經(jīng)雙層濾紙過濾, 鏡檢無藻細胞。(4)藻細胞破碎液：將(2)中的藻細胞重懸液混勻, 超聲波細胞粉碎機將藻細胞打碎。將以上新鮮制備的各種組分以海水稀釋到藻細胞密度是或相當于 1 000個/mL, 以投喂小球藻(密度約為104個/mL)為對照, 另設以消毒海水為實驗液的饑餓組, 每組3個平行, 24 h記錄輪蟲種群數(shù)量。

1.2.3 米氏凱倫藻對鹵蟲存活的影響實驗

鹵蟲實驗容器為12孔板, 實驗體積為5 mL, 實驗溫度為(20±1), ℃鹽度為31±1。取指數(shù)生長中期米氏凱倫藻用0.5 mL計數(shù)框計數(shù)后以海水稀釋, 使藻細胞密度分別達 100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、15 000個/mL, 分別加至12孔板中, 每孔放入大小較為均一的鹵蟲無節(jié)幼體10尾。對照組投喂處于指數(shù)增長期的小球藻(密度為 106個/mL), 以海水為饑餓組, 每組3個平行。每隔24 h觀察記錄各組中鹵蟲存活數(shù)(以解剖針觸動鹵蟲, 5 s內觸角不動作為死亡標準), 加入適量蒸餾水調節(jié)鹽度, 48 h更換實驗液, 實驗進行96 h。

1.2.4 米氏凱倫藻對黑褐新糠蝦存活的影響實驗

黑褐新糠蝦實驗容器為500 mL燒杯, 實驗體積為400 mL, 實驗溫度為(20±1),℃ 鹽度為31±1, 取指數(shù)生長中期米氏凱倫藻用0.5 mL計數(shù)框計數(shù)后以海水稀釋, 使藻細胞密度分別達到 2 000、5 000、10 000、15 000個/mL。選取(5±1)日齡健康活潑幼蝦隨機放入配制好的實驗液中, 每杯10尾。以海水作為對照, 每組3個平行。每24 h投喂適量鹵蟲幼體, 吸取死蝦和杯底污物, 并記錄糠蝦的存活數(shù), 每48 h換一次處理液, 實驗共進行16 d。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel中的STDEV以及TTEST等函數(shù)進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 米氏凱倫藻對輪蟲種群數(shù)量的影響

米氏凱倫藻對褶皺臂尾輪蟲種群數(shù)量的影響如圖1所示。24 h時, 對照組的輪蟲種群數(shù)量有所增加,饑餓組中輪蟲種群數(shù)量仍維持在起始狀態(tài)。其他各密度組的輪蟲種群數(shù)量均有一定程度的下降, 而且隨著米氏凱倫藻藻細胞密度升高, 輪蟲種群數(shù)量降低程度越明顯, 至 20個/mL時, 輪蟲種群數(shù)量與饑餓組有顯著差異(P＜0.05), 當藻細胞密度達到40個/mL和80個/mL時, 輪蟲種群數(shù)量與饑餓組有極顯著差異(P＜0.01)。米氏凱倫藻對輪蟲的24 h EC50約為 20個/mL。由實驗結果可見, 米氏凱倫藻藻細胞對輪蟲具有很強的毒性作用。

圖 1 不同密度米氏凱倫藻對輪蟲種群數(shù)量的影響(CT：對照; SV：饑餓)Fig. 1 The effect of K. mikimotoi on rotifer B. plicatilis population (CT： control; SV： starvation)

2.2 米氏凱倫藻不同組分對輪蟲種群數(shù)量的影響

為了探明米氏凱倫藻對輪蟲的毒性來源, 作者比較了藻的各組分：藻培養(yǎng)液、藻細胞重懸液、藻培養(yǎng)液過濾液、藻細胞破碎液對輪蟲種群數(shù)量的影響。由圖2可見, 24 h后藻的各組分中只有藻液和藻細胞重懸液使輪蟲種群數(shù)量顯著降低(P＜0.01), 分別減少了 98%和 85%, 其他組分中的輪蟲種群數(shù)量與饑餓組無顯著性差異?？磥碇挥型暾幕钤寮毎?藻培養(yǎng)液和藻細胞重懸液) 才具有對輪蟲的急性致死效應, 因此該藻的毒性可能與藻細胞活性有關。

圖2 米氏凱倫藻不同組分對輪蟲種群數(shù)量的影響Fig. 2 The effect of different fractions on rotifer B. plicatilis populationA.對照; B.饑餓; C.藻培養(yǎng)液; D.藻細胞重懸液; E.藻培養(yǎng)液過濾液; F.藻細胞破碎液A. Control; B. Starvation; C. Algal culture; D. Re-suspended algal cells; E. Filtrate; F. Broken cells

2.3 米氏凱倫藻對鹵蟲存活的影響

米氏凱倫藻對鹵蟲存活的影響如圖3所示。24 h,各實驗組中鹵蟲的存活率均在90%以上; 48 h后除對照組外, 其他各組中的鹵蟲存活率都呈現(xiàn)下降的趨勢, 且各藻密度組中鹵蟲的存活率與饑餓組之間沒有顯著性差異, 說明在僅有米氏凱倫藻存在的條件下鹵蟲不能存活, 饑餓可能是造成其死亡的原因。在實驗中觀察到高密度組中鹵蟲被黏性物質纏在一起, 不能自由運動, 藻細胞外黏液及毒性物質可能也是導致鹵蟲死亡的原因。

圖3 米氏凱倫藻對鹵蟲存活的影響Fig. 3 The effect of K. mikimotoi density on brine shrimp A.salina

2.4 米氏凱倫藻對黑褐新糠蝦存活的影響

米氏凱倫藻對黑褐新糠蝦存活的影響如圖 4所示。16 d時, 糠蝦的存活率隨藻細胞密度的增加而下降, 在低密度(＜5 000個/mL)下糠蝦的存活率為100%, 而在10 000、15 000個/mL密度下, 糠蝦的存活率分別為77%和27%, 其中15 000個/mL密度中的糠蝦存活率與對照組有極顯著的差異(P＜0.01)。米氏凱倫藻對糠蝦的16 d半致死密度(16 d LD50) 約為12 500個/mL。

圖4 米氏凱倫藻對黑褐新糠蝦存活的影響Fig. 4 The effect of K. mikimotoi density on Neomysis awatschensis

3 討論

3.1 米氏凱倫藻赤潮對海洋生態(tài)系統(tǒng)的潛在危害

一般認為米氏凱倫藻赤潮的危害有以下三種途徑： 首先, 在赤潮發(fā)生時藻細胞夜間呼吸以及在赤潮消退期藻細胞分解會消耗大量氧氣, 產生低氧環(huán)境; 其次, 米氏凱倫藻能產生溶血毒素、魚毒素[21,22]、活性氧[25]及部分細胞毒素[24,25]等; 再次, 米氏凱倫藻赤潮發(fā)生時海水中存在黏液性物質或者泡沫[2,26～28],Partensky[29]認為由此造成的海水黏滯性增加是導致海洋生物死亡的主要原因。

當米氏凱倫藻赤潮爆發(fā)時, 人們一般只關注其造成的魚類等個體較大生物的死亡, 而根據(jù)本研究的結果, 2×104個/L密度的米氏凱倫藻24 h就能導致輪蟲數(shù)量減少一半, 且韓剛等[9]在現(xiàn)場實驗中發(fā)現(xiàn),米氏凱倫藻赤潮能夠顯著降低中華哲水蚤的數(shù)量,相關研究還發(fā)現(xiàn)凱倫藻能導致沙蠶、牡蠣幼體和鮑魚幼體的死亡, 抑制扇貝受精卵分裂并導致其胚胎發(fā)育異常等[21,26,30～32]。因此可以推測, 在米氏凱倫藻赤潮發(fā)生時, 某些浮游動物可能已經(jīng)會出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象。因此, 凱倫藻赤潮對浮游動物的種群數(shù)量,以及整個海洋生態(tài)系統(tǒng)的負面影響也值得關注。

3.2 不同生物對米氏凱倫藻敏感性的比較

本實驗中 3種生物對于米氏凱倫藻的敏感性差異非常明顯。其中輪蟲最為敏感, 然后依次為鹵蟲和糠蝦。24 h輪蟲數(shù)量和藻細胞密度對數(shù)值間的線性方程為： y = -6.367x + 13.684, R2= 0.902 6, 以此計算,當暴露于2 000個/mL的米氏凱倫藻中時, 24 h內輪蟲將全部死亡。而在此密度下, 24 h內鹵蟲的存活率為100%, 96 h后才大量死亡。黑褐新糠蝦在2 000個/mL的米氏凱倫藻中卻能夠存活至少 16 d, 當密度達到10 000個/mL時才出現(xiàn)死亡。敏感性的差異可能是由于它們具有不同的生理結構、代謝途徑和攝食方式等造成的。

有學者指出甲藻對褶皺臂尾輪蟲的毒害作用是由于藻細胞和輪蟲之間發(fā)生頻繁碰撞而影響了輪蟲體內某些生理功能, 并刺激了藻細胞毒性物質的釋放[33,34]。Zou等[35]在研究一株米氏凱倫藻時也發(fā)現(xiàn)該藻藻細胞對褶皺臂尾輪蟲具有急性致死作用, 當藻細胞與輪蟲之間的直接接觸被阻斷時, 這種毒性作用會隨之消失, 且藻培養(yǎng)液過濾液與藻細胞破碎液不具有這種毒性作用, 說明完整藻細胞的直接接觸是導致輪蟲死亡的關鍵因素; 通過化學方法去除藻細胞可能含有的活性氧后, 毒性作用仍然存在,且該藻對輪蟲的毒性作用與其溶血活性具有一定的相關性, 說明這種毒性作用與活性氧無關, 其可能與溶血活性有關; 他們在實驗中觀察到, 當暴露在米氏凱倫藻藻細胞中, 部分輪蟲的頭冠會被黏性分泌物包裹并出現(xiàn)泡沫狀結構。綜上所述, 他們認為米氏凱倫藻對褶皺臂尾輪蟲的毒性作用可能是由于直接接觸造成了頭冠等敏感部位膜結構的損傷。鹵蟲是一種鰓足類甲殼生物, 它的鰓裸露位于附肢基部,容易受到米氏凱倫藻產生的毒性物質的毒害。雖然米氏凱倫藻中鹵蟲存活率的下降趨勢與饑餓組相似,但實驗發(fā)現(xiàn)鹵蟲能夠攝食米氏凱倫藻, 藻細胞可能給鹵蟲提供部分營養(yǎng), 可能由于藻細胞提供營養(yǎng)不足, 或者在攝入藻細胞的同時攝入了某些有害物質而導致鹵蟲死亡, 高密度藻細胞產生的黏性物質也可能是導致鹵蟲死亡的原因。黑褐新糠蝦雖不攝食藻細胞, 但由于鹵蟲能夠攝食米氏凱倫藻, 毒性物質可能通過鹵蟲的傳遞或在糠蝦捕食和吞水過程中進入糠蝦體內, 從而對其產生毒性影響。在今后的實驗中, 作者將使用雙殼貝類和魚類等作為受試生物,使研究結果更充分地反映出有害赤潮可能對海洋生態(tài)系統(tǒng)各種生物造成的影響。致謝： 本實驗得到了中國科學院海洋研究所張利永博士在藻類培養(yǎng)方面的指導, 以及湯士英和別煥章師傅在生物培養(yǎng)方面的大力協(xié)助, 在此一并致以謝忱。

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Effect of Karenia mikimotoi on the survival of rotifer Brachionus plicatilis, brine shrimp Artemia salina, and Neomysis awatschensis

SUN Ke1,2, YAN Tian1, ZHOU Ming-jiang1, Ho KC3
(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Graduate School, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China; 3. School of Science and Technology, The Open University of Hong Kong, Hong Kong 999077)

Mar., 25, 2010

Karenia mikimotoi; Brachionus plicatilis; Artemia salina; Neomysis awatschensis; population; survival

In this paper, we analyzed the distribution of blooms caused by Karenia sp. in China and the toxicity of Karenia mikimotoi to Brachionus plicatilis, Artemia salina, and Neomysis awatschensis. The population of B. plicatilis was significantly decreased when exposed to K. mikimotoi at low densities and the 24h EC50was about 20 cells/mL. Comparison of the toxicities of different algal fractions showed that the algal culture and re-suspended algal cells had the adverse effects, but the broken cells and filtrate showed little impact, indicating that the inhibitory effect was mainly related to the active whole algal cells. The survival of A. salina or N. awatschensis was significantly decreased when exposed to K. mikimotoi. The results suggest that K. mikimotoi blooms might directly impact zooplankton survival.

S963.14

A

1000-3096(2010)09-0076-06

2010-03-25;

2010-06-12

中國科學院創(chuàng)新項目(KZCX2-YW-208); 國家自然科學基金項目(U0733006); 國家 973計劃項目(2010CB428700)

孫科(1985-)男, 山東淄博人, 碩士研究生, 研究方向：海洋生態(tài)學, E-mail： sunke20021@126.com; 顏天, 通信作者, 主要從事赤潮危害機制研究, E-mail： tianyan@qdio.ac.cn

(本文編輯： 梁德海)