張丹丹 ,金 宏,趙文英,金 巖

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院,山東青島266042)

萬古霉素手性固定相分離克倫特羅對映體

張丹丹＊,金 宏,趙文英,金 巖

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院,山東青島266042)

應(yīng)用萬古霉素手性固定相對克倫特羅對映體進(jìn)行了分離,考察了洗脫模式、流動相組成、柱溫等因素對分離的影響,并對其分離機制進(jìn)行了探討.最佳色譜條件為:甲醇-冰醋酸-三乙胺(體積比100∶0.01∶0.01),流速1.0 mL/min,柱溫20℃.在此條件下,克倫特羅對映體可實現(xiàn)基線分離,最大分離度可達(dá)2.67.克倫特羅對映體與固定相之間的離子相互作用是實現(xiàn)對映體分離的最主要分離機制.

萬古霉素;手性固定相;克倫特羅;對映體;手性分離

隨著醫(yī)藥學(xué)和生命科學(xué)的發(fā)展,人們逐漸發(fā)現(xiàn)藥物對映異構(gòu)體在藥理、毒理和臨床療效等方面存在著較大的差異,因此藥物對映體的拆分工作具有重要意義.克倫特羅是β2腎上腺受體激動劑,主要用于防治人、畜支氣管哮喘和痙攣[1].克倫特羅分子中含有一個手性中心(其結(jié)構(gòu)式見圖1),目前臨床上應(yīng)用的克倫特羅均為外消旋體,但研究表明,在臨床上有效的一般為其(-)-異構(gòu)體,而(+)-異構(gòu)體則對療效沒有貢獻(xiàn)[2].因此,對克倫特羅對映體進(jìn)行拆分研究,建立快速、靈敏、分離性能好的測定方法是一個具有理論及實際意義的課題.目前,對該藥物的拆分主要有高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法.如宋雅茹等人將酰胺型手性固定相用于高效液相色譜拆分克侖特羅對映體[3];唐琴等人用Whelk-O1手性固定相成功拆分了克倫特羅對映體[4];黃可龍等人用毛細(xì)管電泳法以羥丙基-β-環(huán)糊精為手性添加劑拆分了克侖特羅對映體[5].但至今還沒有關(guān)于利用萬古霉素手性固定相對克侖特羅進(jìn)行手性拆分的報道.本實驗首次采用萬古霉素手性固定相對克倫特羅對映體進(jìn)行了分離,并從結(jié)構(gòu)上探討了手性分離的機制.萬古霉素手性固定相的結(jié)構(gòu)式如圖2所示.

圖1 克倫特羅的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of clenbuterol

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Jasco UV-980高壓輸液泵,Jasco UV-975檢測器(Jasco日本分光公司),IC 2001 plus型柱溫箱,Anastar色譜工作站,U6K型進(jìn)樣閥(20μL定量環(huán)),DT-100A型分析天平,p HS-25型p H計,DL-180型超聲波清洗機.

鹽酸克倫特羅由青島雙鯨藥業(yè)提供;甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、四氫呋喃均為色譜純(天津市康科德科技有限公司);冰醋酸、三乙胺、硝酸銨均為特級純(天津市博迪化工有限公司).

1.2 色譜條件

色譜柱:Chirobiotic V(150×4.6 mm I D,5μm)(Advanced Separation Technologies Inc,美國).最佳流動相:甲醇-冰醋酸-三乙胺(體積比100∶0.01∶0.01).流速1.0 mL/min;紫外檢測波長254 nm;進(jìn)樣量20μL.藥物對照品用甲醇溶解,配制成濃度為1.0 g/L的供試液.

圖2 萬古霉素手性固定相的結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structure of vancomycin-based chiral stationary phase

2 結(jié)果與討論

2.1 分離模式的選擇

萬古霉素手性固定相有正相、反相和新極性有機相三種分離模式.

在正相模式下,考察了兩種流動相系統(tǒng):正己烷/乙醇和正己烷/異丙醇,并通過改變流動相組成以求實現(xiàn)手性分離.令人失望的是,在此模式下,克倫特羅對映體在萬古霉素手性固定相上不能實現(xiàn)分離.

在反相模式下,首先采用廠家建議的0.1%冰醋酸-三乙胺(p H 4.1)-20%甲醇為流動相,考察了克倫特羅保留行為和選擇性受有機改性劑的種類(甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、四氫呋喃等)和濃度(10%～70%),緩沖鹽的性質(zhì)(硝酸銨、醋酸銨)和p H值(4.0～7.0)的影響,但通過優(yōu)化這些分離條件,克倫特羅對映體在萬古霉素手性固定相上均不能實現(xiàn)分離.

在新極性有機相模式下,克倫特羅對映體可獲得分離,最大分離度可達(dá)到2.67,最佳流動相為甲醇-冰醋酸-三乙胺(體積比100∶0.01∶0.01).

2.2 緩沖溶液的選擇

在新極性有機相模式下,考察了醋酸銨、硝酸銨和1%醋酸三乙胺緩沖系統(tǒng)對分離的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),克倫特羅在1%醋酸三乙胺緩沖系統(tǒng)中可以得到手性分離.

2.3 緩沖溶液的濃度和p H

以甲醇-冰醋酸-三乙胺系統(tǒng)作為流動相,考察了冰醋酸和三乙胺的濃度和比例對分離的影響.在萬古霉素手性固定相上,當(dāng)流動相中只含有冰醋酸而不含有三乙胺時,克倫特羅只能檢測到一個變形的色譜峰,不能實現(xiàn)手性分離;在只含有三乙胺的流動相中,克倫特羅對映體可實現(xiàn)一定的分離,但峰形不佳;在三乙胺存在的前提下,冰醋酸的加入可以改善色譜峰的峰形和對稱性,實驗結(jié)果表明,兩者體積比為1∶1時克倫特羅對映體的分離效果最佳.因此,本實驗采用甲醇-冰醋酸-三乙胺(體積比100∶0.1∶0.1)為起始流動相,考察了緩沖液成分(冰醋酸/三乙胺)的濃度對克倫特羅在萬古霉素手性固定相上保留行為和對映體選擇性的影響.隨著冰醋酸/三乙胺的濃度從0.1%降低至0.02%或0.01%,克倫特羅的保留時間明顯延長,分離效果顯著提高;但當(dāng)冰醋酸/三乙胺的濃度繼續(xù)降低至0.005%時,克倫特羅的保留時間過長,色譜峰展寬,分離效果下降.具體數(shù)據(jù)見表1.確定甲醇-冰醋酸-三乙胺(體積比100∶0.01∶0.01)為最佳流動相,此條件下克倫特羅對映體可實現(xiàn)基線分離,最大分離度可達(dá)到2.67,分離色譜圖見圖3.

表1 流動相組成對克倫特羅對映體分離的影響Table 1 Effect of mobile phase composition on the enantioseparation of clenbuterol

2.4 柱溫的影響

柱溫對分離度和保留時間有著重要的影響,以甲醇-冰醋酸-三乙胺(體積比100∶0.01∶0.01)為流動相,考察了克倫特羅對映體在10,20,30和40℃下的分離情況.實驗結(jié)果表明,隨著溫度的升高,克倫特羅的保留時間和對映體選擇性均隨之降低,具體數(shù)據(jù)見表2.權(quán)衡分離度,保留時間及實際操作性,選取最佳分離溫度為20℃.

2.5 分離機制的探討

圖3 克倫特羅對映體的色譜圖Fig.3 Chromatogram of clenbuterol enantiomers

萬古霉素分子中具有多種官能團(tuán)和不對稱中心,可與被分析物質(zhì)產(chǎn)生多種作用,如疏水作用、包合作用、偶極-偶極作用,π-π誘導(dǎo)作用、氫鍵作用、空間位阻作用及范德華相互作用.克倫特羅的結(jié)構(gòu)中具有苯環(huán),羥基,鹵素和氨基基團(tuán),可以與手性選擇劑上相應(yīng)的官能團(tuán)發(fā)生相互作用從而實現(xiàn)手性分離.新極性有機相模式可以提升所有這些相互作用,因此在此模式下,克倫特羅對映體得到了在正相和反相模式下不能實現(xiàn)的分離效果.而在新極性有機相模式下,必須有三乙胺存在于流動相中才可實現(xiàn)克倫特羅對映體的分離,當(dāng)流動相中同時含有三乙胺和冰醋酸時,分離效果最佳,這說明離子作用是此模式下對映體分離的最主要作用機制,而克倫特羅的手性分離是上述提到的各種相互作用的共同結(jié)果.

表2 溫度對克倫特羅對映體分離的影響Table 2 The effects of temperature on the enantioseparation of clenbuterol

[1]孫定人,張石革,梁之江.國家臨床新藥集[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2001,9:358-359.

[2]Gausepohl C,Blaschke G.Stereoselective determination of clenbuterol in human urine by capillary electrophoresis[J].J Chromatogr B:Biomed Sci A pplic,1998,713(2):443-446.

[3]宋雅茹,王德發(fā),楊亦平,等.酰胺型手性固定相直接拆分克倫特羅對映體[J].色譜,2002,20(2):118-120.

[4]唐琴,宋航,付超,等.高效液相色譜手性固定相法拆分克倫特羅對映體[J].分析化學(xué),2004,32(6):755-758.

[5]黃可龍,胡衛(wèi)國,王蔚玲,等.高效毛細(xì)管電泳對克倫特羅對映體的分離及定量檢測[J].分析科學(xué)學(xué)報,2007,23(1):9-12.

Enantioseparation of Clenbuterol by Vancomycin-Based Chiral Stationary Phase

ZHANG Dan-dan,J IN Hong,ZHAO Wen-ying,J IN Yan
(College of Chemical Engineering,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao266042,Shandong,China)

The enantiomers of clenbuterol were separated by using vancomycin-based chiral stationary phase.The effects of elution mode,composition of mobile phase and column temperature on separation efficiency were investigated.The separation mechanism was also explored.Results indicate that the best separation efficiency is achieved at a mobile phase(methanol-acetic acid-triethylamine,volume ratio 100∶0.01∶0.01)flow rate of 1.0 mL/min and temperature of 20℃.It is feasible to realize baseline separation of the enantiomers of clenbuterol under the optimal conditions,with the maximum resolution factor being 2.67.Besides,ionic interaction between the vancomycin-based chiral stationary phase and the enantiomers of clenbuterol is responsible for the chiral separation of the enantiomers.

vancomycin;chiral stationary phase;clenbuterol;enantiomer;chiral separation

O 657.7

A

1008-1011(2010)05-0051-03

2010-06-18.

青島科技大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動基金資助項目(qust0022400).

張丹丹(1978-),女,副教授,博士,主要從事手性藥物的分離分析及其機制研究.E-mail:dandanzhang625@hotmail.com.