杜虹，顏海波，莊東紅，陳偉洲

（汕頭大學生物系，廣東汕頭515063）

細基江蘺繁枝變型在氮及鉛脅迫下的響應

杜虹，顏海波，莊東紅，陳偉洲

（汕頭大學生物系，廣東汕頭515063）

分別研究了細基江蘺在不同濃度氮和鉛脅迫下的生理生化響應.結(jié)果顯示，江蘺日特定生長率、可溶蛋白、藻紅素含量隨氮濃度增大而增大，均在氮濃度為200μmol/L時達到最大；隨著鉛濃度升高，江蘺的日特定生長率、可溶蛋白、藻紅素、葉綠素a呈下降趨勢，SOD、POD、GST的活性則呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢.表明江蘺的生長狀況與氮濃度具有一定的相關性；江蘺對低濃度鉛脅迫具有一定的抵抗能力，受時間和濃度雙重因子的制約.

江蘺；氮；鉛；脅迫

0 引言

細基江蘺繁枝變型（以下簡稱江蘺）隸屬于紅藻門、真紅藻綱、杉藻目、江蘺科，用營養(yǎng)枝進行繁殖，具有適應性強、生長快、產(chǎn)量高、栽培方法簡單、容易推廣、營養(yǎng)儲存庫大、改善生態(tài)環(huán)境以及經(jīng)濟價值高等優(yōu)點.國內(nèi)外大多數(shù)研究主要是針對江蘺屬海藻在受氮、磷污染富營養(yǎng)化海域的生物修復方面和對重金屬的吸附作用[1-3]，而江蘺屬海藻在氮（N）營養(yǎng)鹽和重金屬鉛（Pb）脅迫下的生理生化響應等方面的文獻報道較少，而且重金屬及營養(yǎng)鹽的脅迫是影響江蘺屬海藻生長的兩大主要因素，這兩者對水體的污染幾乎是同步的[4].為此，本實驗著重研究N營養(yǎng)鹽和重金屬Pb對江蘺生理生化的影響，以期為江蘺的種植提供指導及為其作為Pb的環(huán)境污染監(jiān)測和毒理診斷提供研究方法.

1 材料和方法

1.1 材料來源及預培養(yǎng)

江蘺（人工養(yǎng)殖）取自廣東省汕頭市達濠區(qū)人工養(yǎng)殖蝦池，選擇健康藻體，先用天然海水沖洗藻體表面，用鑷子除去雜藻，放在室內(nèi)玻璃缸中預培養(yǎng)一周后挑選粗壯、分枝繁茂整齊、顏色較濃、藻體完整、無損傷腐爛的江蘺進行實驗.適應期水溫（20±1）℃，光照強度2 000 lx，鹽度16‰，光周期12L∶12D，pH為8.0.每天早晚輕微攪動江蘺和海水，使江蘺接受均勻的光照正常生長.

1.2 實驗方法

海水為人工配置（P終濃度為4 μmol/L，微量元素用f/2配方）.氮濃度（添加亞硝態(tài)N，氨態(tài)N，硝態(tài)N，摩爾比是1︰10︰4）分別是0、10、50、100、200、400μmol/L.

鉛實驗：每組培養(yǎng)液（N、P終濃度分別為50、4 μmol/L）分別設Pb濃度為0、0.05、0.5、2.5、5、10 mg/L（以PbCl2形式添加）.

實驗選擇粗細、長短接近的健康江蘺約3g左右（稱量時用濾紙吸干藻體表面水分）于800 mL各組培養(yǎng)液持續(xù)培養(yǎng)，周期7天，每個氮和鉛濃度培養(yǎng)液設置3個平行，每日觀察江蘺的表觀癥狀，隔兩日更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)結(jié)束時稱重.江蘺日特定生長速率的計算公式：x（%/d）=[（wt/w0）1/t－1]×100%，其中，w0為初始時刻江蘺鮮重（g），wt為t時刻江蘺鮮重（g），t為兩次測定間隔時間.培養(yǎng)第3 d、6 d時，測定江蘺藻紅素、葉綠素a、可溶性蛋白含量，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）活性等指標.可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定[5]，藻紅素測定參照達維斯[6]方法，葉綠素a測定參考Moran等[7]方法，SOD、POD、GST活性測定分別采用購買的南京建成生物公司試劑盒：A001超氧化物歧化酶（SOD）測試盒，A084-2過氧化物酶（POD）測定試劑盒，A004GSH-ST測試盒（谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶測試盒）.

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗重復次數(shù)均為3，取平均值并計算標準誤差（S）.以下圖標中的數(shù)據(jù)均為平均值±S，圖中以垂直短線表示S.

2 實驗結(jié)果

2.1 氮濃度影響

2.1.1 對日特定生長率的影響

從圖1可以看出，當N濃度為200 μmol/L時，江蘺的日特定生長率最高，為3.98%，其次是100 μmol/L，為2.75%；與低N實驗組（50、10 μmol/L）相比差異顯著（P＜0.05）；當N濃度增加至400 μmol/L時，其日特定生長率較200 μmol/L

時有所下降.可見江蘺日特定生長速率隨著N濃度的增加而增加，其原因可能是營養(yǎng)鹽濃度的上升可使藻體一系列生理過程的底物濃度升高，但高濃度N會抑制江蘺的生長.

2.1.2 對可溶性蛋白、藻紅素、葉綠素a的影響

圖1 氮濃度對日特定生長率的影響

氮濃度對江蘺可溶性蛋白、藻紅素、葉綠素a的影響w1、y1、z1見圖2.由圖2可以看出，當N濃度小于200 μmol/L時，江蘺的可溶性蛋白、藻紅素的含量均隨著N濃度的增加而增大，在200 μmol/L時達到最大，分別是6.23%和0.282 mg/g；當N濃度進一步升高，達到400 μmol/L時，可溶性蛋白和藻紅素含量呈下降趨勢.但葉綠素a的含量與N濃度的關系不是很明顯.這些指標在第3天和第6天沒有明顯的區(qū)別，提示了N對江蘺生理生化的影響從第3天（或更早）已經(jīng)發(fā)揮了作用.

2.2 鉛濃度影響

2.2.1 對日特定生長率的影響

從圖3可以看出，隨著Pb濃度的增加，江蘺日特定生長率呈下降趨勢，在Pb為10 mg/L時最低，為1.68%，而最高則是當Pb濃度0.05 mg/L時，為2.93%.方差分析知，高濃度Pb實驗組(5、10 mg/L)江蘺日特定生長率與低濃度Pb實驗組相比(0.05、0.5 mg/L)差異顯著（P＜0.05）.

2.2.2 對可溶性蛋白、藻紅素、葉綠素a的影響

鉛濃度對江蘺可溶性蛋白、藻紅素、葉綠素a的影響w2、y2、z2見圖4.由圖4可以看出，江蘺可溶性蛋白、藻紅素和葉綠素a的含量都隨著Pb濃度的增大而呈下降趨勢，在處理濃度為0.05、0.5和2.5 mg/L時，與對照組相比均沒有顯著性變化；而當Pb濃度進一步升高且處理時間延長時，這些指標與對照組相比出現(xiàn)顯著性下降（P＜0.05）.

2.2.3 對SOD、POD、GST活性的影響

圖2 氮濃度對可溶性蛋白、藻紅素、葉綠素a的影響

圖3 鉛濃度對日特定生長率的影響

圖4 鉛濃度對可溶性蛋白、藻紅素、葉綠素a的影響

由圖5所示，Pb對江蘺SOD、POD、GST活性的影響P1、P2、P3均隨其濃度的增加呈現(xiàn)出先升后降的趨勢.SOD活性峰值（248.6 U/mg）出現(xiàn)在Pb為2.5 mg/L，高出對照組19.2%；POD和GST的活性峰值分別為247.12和79.6 U/mg，均出現(xiàn)在Pb為5 mg/L，并分別高于對照組60.1%和43.0%.但當再增加Pb處理濃度時，江蘺SOD、POD、GST活性則出現(xiàn)明顯的下降趨勢，且均低于對照組.由圖5還可以看出，Pb對江蘺SOD、GST活性的影響主要與其濃度有關，與處理時間關系不明顯，而Pb對POD活性的影響則與處理濃度和時間均相關.

3 討論

圖5 鉛濃度對SOD、POD、GST活性的影響

氮是海藻生長過程中非常重要的一種營養(yǎng)元素，一般情況下海藻生長率的變化與外界N供應

的變化相一致[8]，外界營養(yǎng)供應影響海藻體內(nèi)的化學組成、發(fā)育、形態(tài)、繁殖及分布[9].本實驗結(jié)果表明，在其它環(huán)境因子如溫度、鹽度、光照、pH值等固定時，江蘺的日特定生長率隨著N濃度的增加而增加，其原因可能是江蘺體內(nèi)藻紅素含量的提高促進江蘺的光合作用（藻紅素是紅藻光合作用過程中將光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W能的關鍵色素）.但當N濃度升高到400 μmol/L時，藻紅素在藻體內(nèi)的含量降低，進而抑制江蘺的生長[10].表明藻紅素與介質(zhì)中N濃度具有一定的相關性，并且這種相關性必須要求N濃度在一定的范圍內(nèi)，即不超過200 μmol/L.

在不同的N水平下，江蘺藻體內(nèi)的葉綠素a含量變化不大，暗示著藻體內(nèi)葉綠素a含量與環(huán)境中的N濃度關系（N缺乏時間不長時）不密切，而是與環(huán)境因子中的光照、溫度等相關，如高光照和低溫可促進海藻葉綠素的生成[11-13].

有研究表明N濃度的高低會引起藻體色澤的變化[9，14-15]，本研究顯示當N濃度超過200 μmol/L時，可能超過了江蘺藻體N儲藏庫的最大允許容量，進入藻體的N不能參與蛋白的合成和生長，而且無機氮（NO2-，NH4+）濃度過高對江蘺有毒害作用，導致江蘺不能正常生長，藻體內(nèi)的可溶蛋白含量呈下降趨勢，藻體也因此由褐色逐漸轉(zhuǎn)變成黃色、白色.說明了江蘺對N的吸收可能存在一個臨界飽和點，超過這個點，將會對江蘺的生長起抑制作用.

重金屬是嚴重的環(huán)境污染物，對植物和動物都具有高毒性.在所有的重金屬當中，鉛是一種劇毒金屬物質(zhì)，是人體非必須元素，對很多組織都有毒性，隨著采礦、冶煉以及Pb處理等工業(yè)的發(fā)展，Pb污染問題日益嚴重，而且遍及人類的整個活動范圍.本實驗中Pb污染引起江蘺藻紅素、葉綠素a和可溶性蛋白含量減小，并且隨其脅迫時間的推移，下降越顯著，說明鉛在藻體內(nèi)逐漸積累，對江蘺的傷害逐漸顯現(xiàn)，各項指標值不斷下降.藻紅素作為天線色素參與光合作用，容易受到環(huán)境因素的影響[16]，本實驗結(jié)果也證實，各培養(yǎng)組藻紅素的含量均隨著鉛濃度增加而下降.可溶蛋白和葉綠素a含量的下降可能是由于重金屬離子與—SH基結(jié)合導致蛋白變性，也可能是由于重金屬取代了酶蛋白的活性中心，致使其失活，從而阻礙了葉綠素等的合成，或取代其中的Fe2+、Zn2+等，直接破壞葉綠體的結(jié)構(gòu)，或DNA翻譯轉(zhuǎn)錄途徑受阻，影響了蛋白質(zhì)的合成，進而影響江蘺可溶蛋白的含量.

SOD和POD協(xié)同作用可以降低氧自由基等對江蘺細胞膜結(jié)構(gòu)潛在傷害的可能性，GST是提供細胞還原力的一個主要的酶.在低濃度Pb脅迫處理時，江蘺體內(nèi)的SOD、POD、GST活性升高，但高濃度Pb存在時，這3個酶的活性下降.表明江蘺對Pb有一定的抗性，但存在一定的閾值，當超過這一閾值時，可能致使細胞內(nèi)長時間地維持在較高的O2-，細胞內(nèi)的活性物質(zhì)包括酶會受到損傷，導致其活性下降.因此，江蘺對重金屬Pb在一定濃度范圍內(nèi)（0~5 mg/L）具有一定的耐受能力，反映在外觀表征變化不是很明顯，各項生理生化指標變化不是很劇烈，體內(nèi)酶活力有一定的上升趨勢；當鉛濃度超過了5 mg/L時，毒性逐漸顯示出來，無論是表觀癥狀還是生理生化指標均與對照組有很明顯的變化，體內(nèi)的酶活力也急劇下降.

本實驗研究了N營養(yǎng)鹽和重金屬Pb對江蘺生理生化的影響，為江蘺的種植提供了一定的指導及為Pb的環(huán)境污染監(jiān)測和毒理診斷提供了研究方法.

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Gracilaria Tenuistipitata in Response to Nutrients and Heavy Metal Pb Stress

DU Hong,YAN Hai-bo,ZHUANG Dong-hong,CHEN Wei-zhou
(Department of Biology，Shantou University，Shantou 515063，Guangdong，China)

In different concentration of inorganic nitrogen and heavy metal Pb，the physiological and biochemical responses of Gracilaria tenuistipitata are investigated.The resultshows thatthegrowthrate，thecontentofsolubleprotein,thecontentof phycoerythrininGracilariatenuistipitatawiththeincreaseoftheconcentrationof inorganic nitrogen reaches maximum when the concentration of inorganic nitrogen is 200 μmol/L.As the Pb concentration increases，the growth rate,the content of phycoerythrin,the content of Chlorophyll a and soluble protein all decrease.The activity of SOD，POD，GST increases at first，and then shows a downward trend.Studies have shown thatGracilariatenuistipitata’sgrowthconditionrelevantwiththeconcentrationof inorganic nitrogen and Gracilaria tenuistipitata has certain ability to resist the Pb stress on the low concentration.The poison effects of Pb on Gracilaria tenuistipitata are constrained by time and the concentration of dual-factor.

Gracilaria tenuistipitata；nitrogen；Pb；stress

Q 89

A

1001-4217（2010）01-0029-06

2009-09-23

杜虹（1976-），女，廣東汕頭人，博士，副教授.研究方向：近岸水域生態(tài)學和海洋環(huán)境保護研究.E-mail：hdu@stu.edu.cn

廣東省科技計劃重點項目資助（2006A36502001；2007A032600003）