于麗娜，宮清軒，楊慶利*，孫 杰，畢 潔，張初署，于 洋

(山東省花生研究所，山東 青島 266100)

雙酶分步水解制備花生多肽工藝優(yōu)化

于麗娜，宮清軒，楊慶利*，孫 杰，畢 潔，張初署，于 洋

(山東省花生研究所，山東 青島 266100)

為了開發(fā)和利用花生蛋白資源，生產(chǎn)高附加值蛋白產(chǎn)品，以花生分離蛋白為原料，采用Alcalase和Flavourzyme分步水解法制備花生多肽。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，研究Flavourzyme水解花生分離蛋白過程中加酶量、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解溫度、酶解時(shí)間和酶液pH值等因素對(duì)水解的影響。建立水解液中可溶性氮質(zhì)量濃度與各種影響因素的回歸模型；確定Flavourzyme酶解反應(yīng)的最佳工藝參數(shù)為pH7.0、加酶量1714U/g底物、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間90min。在此條件下，酶解產(chǎn)物中可溶性氮質(zhì)量濃度為19.44mg/mL。

雙酶分步水解；花生分離蛋白；花生多肽；制備工藝優(yōu)化

我國(guó)是世界花生生產(chǎn)、消費(fèi)和出口大國(guó)，花生種植面積和年產(chǎn)量均居世界前列[1]?；ㄉ牡鞍踪|(zhì)含量為25%～30%，花生蛋白含有人體必需的八種氨基酸，精氨酸含量高于其他堅(jiān)果，生物學(xué)效價(jià)高于大豆[2]。目前，中國(guó)對(duì)花生的利用多在食用油脂方面，對(duì)花生蛋白的利用較少。而國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的花生蛋白產(chǎn)品主要是花生蛋白粉[3]，它主要作為食品加工的基礎(chǔ)原料，進(jìn)一步將花生蛋白粉加工制備成花生多肽的研究和產(chǎn)業(yè)化較少。多項(xiàng)研究表明，花生蛋白經(jīng)蛋白酶水解制備成花生多肽后具有多種生理活性，包括抗氧化作用[4-7]、抗菌作用[8]、降血壓作用[9-12]等。因此，研究花生蛋白粉酶解工藝制備花生多肽，可以開發(fā)和利用花生蛋白粉這一巨大的潛在蛋白資源，生產(chǎn)高附加值蛋白產(chǎn)品。本研究以脫脂花生蛋白粉制成的花生分離蛋白為原料，以Alcalase和Flavourzyme為工具酶分步水解制備花生多肽。主要對(duì)Flavourzyme水解工藝中的加酶量、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解溫度、酶解時(shí)間和酶液pH值等影響因素進(jìn)行了研究，確定了Flavourzyme水解花生分離蛋白的最佳工藝參數(shù)，旨在為花生多肽產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

一級(jí)脫脂花生蛋白粉 山東天申生物蛋白有限公司；Alcalase和Flavourzyme(食品級(jí)) Novozymes公司；Folin-Ciocalteu's phenol Reagent Sigma公司；牛血清白蛋白(分析純) 北京索萊寶科技有限公司；酪蛋白(化學(xué)純) 成都市科龍化工試劑廠；酪氨酸(BR) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；冷凍干燥機(jī)北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；恒溫磁力攪拌器 常州國(guó)華電器有限公司；雙功能水浴恒溫振蕩器 金壇市杰瑞爾電器有限公司；Ultrospec 2100 pro UV/Visible Spectrophotometer GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 花生分離蛋白的制備方法

取花生蛋白粉以1:10的料液比溶于pH10.0的堿液中，40℃恒溫水浴振蕩浸提1.5h，以3000r/min離心10min，保留上清液，沉淀再經(jīng)相同條件浸提、離心，合并兩次上清液。上清液中加入酸調(diào)節(jié)pH值至4.50左右，靜置0.5h后以3000r/min轉(zhuǎn)速離心15min，取沉淀物經(jīng)兩次95%乙醇洗滌后，再用蒸餾水洗至中性，經(jīng)冷凍干燥得到花生分離蛋白。

1.3.2 雙酶分步水解花生分離蛋白制備花生多肽方法

首先用Alcalase水解花生分離蛋白，再用Flavourzyme繼續(xù)水解的方法制備花生多肽。取花生分離蛋白粉加入蒸餾水，使之溶解后，放入90℃恒溫水浴中保持20min，使花生分離蛋白鈍化。取出后調(diào)節(jié)蛋白液的pH值為8.0，加入Alcalase，在55℃的恒溫水浴振蕩器中反應(yīng)120min。反應(yīng)結(jié)束后，調(diào)節(jié)蛋白液的pH值，加入Flavourzyme混合均勻，在一定溫度的恒溫水浴振蕩器中反應(yīng)一定時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后立即取出，放入100℃水浴中保持5min，使酶失活，冷水冷卻，測(cè)定水解液中可溶性氮含量。

雙酶分步水解花生分離蛋白制備花生多肽工藝流程：

花生分離蛋白粉→蒸餾水→加熱鈍化→調(diào)pH8.0→Alcalase→55℃反應(yīng)120min→調(diào)pH值→Flavourzyme→恒溫水解反應(yīng)→加熱滅酶→水解液

1.3.3 雙酶分步水解花生分離蛋白制備花生多肽試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法

固定Alcalase水解花生分離蛋白條件，研究Flavourzyme水解花生分離蛋白的工藝條件。以加酶量、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶液pH值作為試驗(yàn)因素，以酶解液中可溶性氮質(zhì)量濃度作為考察指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)因素和水平如表1所示。單因素試驗(yàn)的基本反應(yīng)條件：加酶量為1285U/g底物、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間120min、酶液pH7.0。

表1 單因素試驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels in the single factor design

1.3.3.2 響應(yīng)面(response surface methodology，RSM)中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)

在固定酶液pH值條件下，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)，運(yùn)用Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇對(duì)酶解液中可溶性氮含量有顯著影響的4個(gè)因素：加酶量(X1)、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X2)、酶解溫度(X3)、酶解時(shí)間(X4)，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以酶解液中可溶性氮質(zhì)量濃度作為響應(yīng)變量(Y)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼見表2。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析采用Design-expert軟件。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 2 Factors and levels in the response surface design

1.3.4 酶活力測(cè)定方法

蛋白酶酶活力定義：1g蛋白酶在pH7.0或pH8.0，40℃的條件下，每分鐘水解酪蛋白能產(chǎn)生1μg酪氨酸，定義為一個(gè)酶活力單位，以U/g或U/mL表示。具體用Folin-酚法測(cè)定[13]，取3支干燥的試管，分別標(biāo)記為對(duì)照管和1號(hào)、2號(hào)管。在3支試管中分別加入磷酸緩沖液和蛋白酶液各1.0mL，然后，在對(duì)照管中加入0.4mol/L三氯醋酸溶液3.0mL，再向各管加入1%酪蛋白溶液1.0mL，在40℃水浴保溫15min后，向1號(hào)和2號(hào)管加入0.4mol/L三氯醋酸溶液3.0mL?；靹蚝蟾鞴芊謩e過濾，吸取濾液1mL，放在干燥的10mL帶塞刻度試管中，加入0.4mol/L碳酸鈉溶液5.0mL，F(xiàn)olin-酚試劑1.0mL，混勻，于40℃水浴保溫15min，然后，每管各加入3mL蒸餾水，混勻。用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)680nm處，以對(duì)照管為對(duì)照調(diào)“0”，測(cè)定兩管的吸光度。并計(jì)算酶活力。

式中：m為根據(jù)樣品所測(cè)定的吸光度，經(jīng)查標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酪氨酸量/μg；t為酶促反應(yīng)的時(shí)間/min；f為酶的稀釋倍數(shù)。

1.3.5 可溶性氮含量測(cè)定方法

可溶性氮含量采用Lowery法測(cè)定[14]，取水解液1.0mL加入Folin-酚試劑A 5.0mL，混勻，于室溫放置10min。再加入0.5mL Folin-酚試劑，加完后，立刻混勻，在30℃水浴保溫30min。水浴結(jié)束后，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)750nm處，以樣品空白為對(duì)照調(diào)“0”，測(cè)定吸光度，根據(jù)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出可溶性氮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶活力測(cè)定結(jié)果

試驗(yàn)中，Alcalase和Flavourzyme的稀釋倍數(shù)為2000，經(jīng)測(cè)定Alcalase和Flavourzyme活力分別為119040U/mL和85707U/g。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 加酶量對(duì)水解的影響

圖1 加酶量對(duì)水解的影響Fig.1 Effect of enzyme amount on hydrolysis efficiency

水解液中可溶性氮質(zhì)量濃度隨著加酶量的增加總體呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。加酶量增大，酶的水解作用加強(qiáng)，反應(yīng)后水解產(chǎn)物增多。因此，水解液中可溶性氮質(zhì)量濃度增加。但是，加酶量在1714U/g底物以后，可溶性氮質(zhì)量濃度增加趨緩。所以選擇加酶量在857～1714U/g底物作為響應(yīng)面水平范圍。

圖2 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)水解的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on hydrolysis efficiency

2.2.2 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)水解的影響水解液中可溶性氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而呈線性增大趨勢(shì)，且有很好線性相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)R2=0.9988。一般情況下，酶的飽和作用需要一定的酶解溫度和酶解時(shí)間。在本試驗(yàn)條件下，經(jīng)過一定的酶解溫度和酶解時(shí)間作用后，不一定達(dá)到酶的飽和作用效果。因此，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)增大時(shí)，有較多的底物與酶結(jié)合，水解產(chǎn)物增多，則水解液中可溶性氮含量增加?？紤]到試驗(yàn)成本與水解產(chǎn)物的關(guān)系，選擇底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3%～5%作為響應(yīng)面水平范圍。

2.2.3 酶解溫度對(duì)水解的影響

圖3 酶解溫度對(duì)水解的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on hydrolysis efficiency

酶的作用效果受到溫度影響較大。一般情況下，在酶的適用溫度范圍內(nèi)，增加反應(yīng)體系的溫度，則酶解的速度加快，酶解產(chǎn)物增多。如圖3所示，在50～60℃溫度范圍內(nèi)，可溶性氮質(zhì)量濃度隨著溫度升高而增加。雖然在35℃和40℃時(shí)水解液中可溶性氮質(zhì)量濃度較大，但是這兩個(gè)溫度不是酶的適用溫度范圍。而60℃又極易引起酶變性，因此，選擇45～55℃作為響應(yīng)面酶解溫度水平范圍。

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)水解的影響

圖4 酶解時(shí)間對(duì)水解的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on hydrolysis efficiency

當(dāng)加酶量、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶解溫度一定時(shí)，延長(zhǎng)酶解時(shí)間，則水解產(chǎn)物應(yīng)該增多。由圖4可知，可溶性氮質(zhì)量濃度在90min時(shí)為16.64mg/mL，在120min時(shí)可溶性氮質(zhì)量濃度增加為16.8mg/mL，而后可溶性氮質(zhì)量濃度下降再增加，在210min時(shí)可溶性氮含量為16.98mg/mL?？梢?，可溶性氮質(zhì)量濃度在90min后增加趨緩，可能原因是當(dāng)酶解溫度固定時(shí)，一定量的酶只能水解一定數(shù)量的底物，即酶的作用達(dá)到飽和，再延長(zhǎng)酶的作用時(shí)間，也不會(huì)使酶的作用加強(qiáng)。因此，選擇90～150min作為響應(yīng)面酶解時(shí)間水平范圍。

2.2.5 酶液pH值對(duì)水解的影響

圖5 酶液pH值對(duì)水解的影響Fig.5 Effect of pH on hydrolysis efficiency

酶液的pH值影響酶的水解效果，酶屬于生物催化劑，它的水解都有自己最佳的pH值范圍。如圖5所示，隨著酶液pH值的增加，水解液中的可溶性氮質(zhì)量濃度呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，在pH值為7.5時(shí)出現(xiàn)最大值。Flavourzyme的適用pH值在7.0左右，雖然pH值為7.5時(shí)水解液中的可溶性氮含量最多，考慮到花生分離蛋白的使用pH值在中性，所以，選取pH7.0作為響應(yīng)面試驗(yàn)的固定pH值，而不帶入響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對(duì)加酶量、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解溫度、酶解時(shí)間4個(gè)因素分別在3個(gè)水平上對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)，共有30個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中包括16個(gè)析因點(diǎn)，6個(gè)中心點(diǎn)和8個(gè)軸向點(diǎn)。析因點(diǎn)代表自變量取值在X1、X2、X3、X44個(gè)變量所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，軸向點(diǎn)代表了每個(gè)獨(dú)立變量的極值水平，中心點(diǎn)代表中心水平，重復(fù)6次以估計(jì)試驗(yàn)誤差。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 Box-Benhnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Box-Benhnken design layout and experimental results

利用Design-Expert軟件對(duì)表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，以響應(yīng)值為因變量，各因素及相互作用為自變量，對(duì)模型進(jìn)行多次擬合，得到模型的回歸方程為：

Y= 15.68＋0.11X1+2.88X2＋0.33X3－0.12X4＋0.079X1X2－0.027X1X3－0.094X1X4＋0.18X2X3－0.15X2X4－0.11X3X4+0.13X12＋0.0034X22－0.25X32＋0.0059X42

對(duì)該模型方程進(jìn)行方差分析，其結(jié)果見表4。由二次多項(xiàng)式方程的方差分析表(表4)可知，響應(yīng)面模型高度顯著(P＜0.01)，表明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的擬合情況良好，因此可以用該回歸方程對(duì)試驗(yàn)真實(shí)值進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。模型預(yù)測(cè)值和實(shí)際值之間具有高度的相關(guān)性，僅有約1.61%的數(shù)據(jù)變異不能用該模型解釋(R2=0.9839)。同時(shí)，模型的變異系數(shù)僅為3.04%，也表明方程擬合度較好。影響因素X2和X3對(duì)可溶性氮質(zhì)量濃度變化的影響是極顯著的，X32對(duì)可溶性氮質(zhì)量濃度變化的影響是顯著的，影響因素的顯著程度大小為X2＞X3＞X4＞X1，即底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞酶解溫度＞酶解時(shí)間＞加酶量。利用模型回歸方程對(duì)試驗(yàn)的各個(gè)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見表3。試驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值相差較小，也說明模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合性較好。但由于儀器誤差和試驗(yàn)過程中的人為因素等的影響，導(dǎo)致個(gè)別試驗(yàn)誤差較大，總體來說模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合性較好。

表4 響應(yīng)面模型二次多項(xiàng)式方程方差分析表Table 4 Variance analysis for the fitted regression model

圖6 各因素對(duì)可溶性氮質(zhì)量濃度影響的趨勢(shì)圖Fig.6 Response surface diagrams showing the pairwise interactive effects of various factors on soluble nitrogen content in peanut protein hydrolysate

由回歸方程也可以分析出，在影響可溶性氮質(zhì)量濃度的因素中，加酶量、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶解溫度與可溶性氮質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，而酶解時(shí)間與可溶性氮質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)。由圖6可知，可溶性氮質(zhì)量濃度隨加酶量的增大而增加，但是變化趨勢(shì)比較平緩；可溶性氮質(zhì)量濃度隨底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而呈直線增加趨勢(shì)，這與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致，變化顯著；可溶性氮質(zhì)量濃度隨酶解溫度的升高而增加，變化顯著；可溶性氮質(zhì)量濃度隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而減小，但是變化趨勢(shì)比較平緩。

利用Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行典型性分析，獲得最優(yōu)的水解工藝條件：X1=1714U/g底物、X2=5%、X3=55℃、X4=90min，即加酶量1714U/g底物、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間90min，在此條件下得到的可溶性氮質(zhì)量濃度的理論最大值為19.59mg/mL。經(jīng)過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得出在此條件下，可溶性氮質(zhì)量濃度19.44mg/mL，與理論值相比誤差小于2%。

3 結(jié) 論

利用花生分離蛋白為原料，首先用Alcalase水解蛋白，再用Flavourzyme繼續(xù)水解的分步水解法制備花生多肽。本實(shí)驗(yàn)主要研究了Flavourzyme水解蛋白的最佳工藝條件。通過單因素試驗(yàn)和四因素三水平中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定出底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶解溫度對(duì)蛋白的水解影響極顯著，各因素對(duì)水解的影響順序依次為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解溫度、酶解時(shí)間和加酶量；最佳的水解工藝條件：pH7.0、加酶量1714U/g底物、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間90min?；ㄉ嚯木哂泻芎玫目寡趸⒁志徒笛獕鹤饔茫肁lcalase和Flavourzyme分步水解花生分離蛋白制備花生多肽是提高花生綜合加工效益的有效途徑，這種工藝技術(shù)的深入研究對(duì)我國(guó)花生蛋白精深加工技術(shù)的進(jìn)步會(huì)起到很好的促進(jìn)作用。

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Optimization of Stepwise Dual-enzymatic Preparation of Peanut Polypeptides

YU Li-na，GONG Qing-xuan，YANG Qing-li*，SUN Jie，BI Jie，ZHANG Chu-shu，YU Yang(Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, China)

In order to exploit and utilize peanut protein resource and obtain high value-added protein products, defatted peanut protein powder was subjected to stepwise hydrolysis initially with alcalase followed by flavourzyme. The conditions for flavourzyme hydrolysis was optimized by response surface methodology in the present study. The effects of enzyme amount,substrate concentration, hydrolysis temperature, hydrolysis time and pH on soluble nitrogen content in peanut protein hydrolysate were explored by single-factor method, and a mathematical regression model describing soluble nitrogen content in peanut protein hydrolysate at different levels of four other factors except pH was established. The optimal process parameters for flavourzyme hydrolysis were found to be: pH, 7.0; enzyme amount, 1714 U/g substrate; hydrolysis temperature, 55 ℃; and hydrolysis duration, 90 min. Te soluble nitrogen content in the peanut protein hydrolysate obtained under the above conditions was 9.44 mg/mL.

stepwise dual-enzymatic hydrolysis；peanut protein isolate；peanut polypeptide；preparation optimization

TS201.1；TS229

A

1002-6630(2010)20-0220-06

2010-06-29

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008BAD97B04)；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)(nycytx-19)；

青島市公共領(lǐng)域科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(09-1-1-84-nsh)

于麗娜(1974—)，女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)榛ㄉδ鼙＝∈称返拈_發(fā)與應(yīng)用。

E-mail：lhtyln0626@yahoo.com.cn

*通信作者：楊慶利(1977—)，男，助理研究員，博士，研究方向?yàn)榛ㄉC合利用與加工。E-mail：rice407@163.com