陳操,秦超,劉維鋼,王維山,董金波,史晨輝

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,石河子832002;

2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院(新疆兵團(tuán)醫(yī)院),烏魯木齊810000)

白介素18髓核內(nèi)注射對(duì)兔椎間盤作用的實(shí)驗(yàn)研究

陳操1,秦超1,劉維鋼2,王維山1,董金波1,史晨輝1

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,石河子832002;

2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院(新疆兵團(tuán)醫(yī)院),烏魯木齊810000)

為探討白介素18(IL-18)髓核內(nèi)注射對(duì)兔椎間盤蛋白多聚糖和基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)的影響。方法采用健康大白兔72只,體重2.5～3 kg。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組48只,陰性對(duì)照組16只,空白對(duì)照組8只。實(shí)驗(yàn)組(IL-18組):隨機(jī)分為3組,每組16只。選擇L4～L5椎間盤,分別注射濃度為10 ng/μL、20 ng/μL、40 ng/μL的IL-18各1μL。陰性對(duì)照組(生理鹽水組):椎間盤內(nèi)注射1μL的生理鹽水?？瞻讓?duì)照組:不作任何處理。分別于第3、6周取相應(yīng)椎間盤作HE染色、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MMP-3的表達(dá)及蛋白多聚糖含量測(cè)定。結(jié)果顯示:①HE染色顯示,隨著IL-18濃度加大,髓核中細(xì)胞數(shù)量減少,正常組織結(jié)構(gòu)破壞越嚴(yán)重,空泡狀結(jié)構(gòu)減少,細(xì)胞核的形態(tài)由橢圓形變?yōu)槎喾N形態(tài)。②3周時(shí)陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組髓核蛋白多聚糖沒有明顯變化,實(shí)驗(yàn)組蛋白多聚糖下降明顯(15.72%～43.78%,P<0.001)。6周時(shí)陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組髓核蛋白多聚糖比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并且實(shí)驗(yàn)組蛋白多聚糖下降程度與IL-18注射劑量呈正相關(guān)(P<0.05))。③實(shí)驗(yàn)組均發(fā)現(xiàn)表達(dá)MMP-3的陽性細(xì)胞,隨時(shí)間延長陽性細(xì)胞數(shù)量逐漸增多,并且陽性率與IL-18注射劑量及時(shí)間呈正相關(guān)(P<0.05)。3周時(shí)陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組很少發(fā)現(xiàn)表達(dá)MMP-3的陽性細(xì)胞,而6周時(shí)陰性對(duì)照組MMP-3的陽性細(xì)胞表達(dá)增多,與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:椎間盤內(nèi)注射IL-18能夠?qū)е伦甸g盤內(nèi)蛋白多聚糖含量降低,促進(jìn)腰椎間盤內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)的表達(dá),可能加速椎間盤的退變,并且有量效關(guān)系。

白介素-18;椎間盤;蛋白多聚糖;金屬蛋白酶-3

Abstract:To investigate the in vivo effects of IL-18 on the content of aggrecan and the expression of MMP-3 on the intervertebral disc.Seventy-two healthy rabbits were randomly divided into three groups,including control group(no intervention of the disc),IL-18 group(IL-18 injectde into the intervertebral discs)and NaCl group(NaCl injectde into the intervertebral discs).L4/5 intervertebral discs were exposed surgically,0.9%NaCl(1μL)and various concentrations(10 ng/μL,20 ng/μL and 40 ng/μL)of IL-18(1μL)were respectiyely injected into L4/5 intervertebral discs.Aggrecan content neasuring and expression of MMP-3 on intervertebral disc were done when the animals were killed in the third and sixth weeks.Results Showed①The HE-staining showed that with the increase of IL-18 the amount of nucleus pulposus cells decreased,reticular framework was broken down,vacuole shape disappeared and oval nucleolus of cells became multi-shape.②In the third week,content of aggrecan had not changed apparently in control and NaCl groups,but in the experiment groups rapid decline(15.72%～43.78%,P<0.001)was evidenced.In the sixth week,content of aggrecan in Nacl group and experiment groups decline(P<0.05),and experiment groups decline were more correlative with the dose of IL-18(P<0.05).③In IL-18 groups the MMP-3 mascuLine cells had homogeneous distribution puncti form moth patch and were increase with the concentrations and the time(P<0.05).ln the third week,there was little expression of MMP-3 in control and NaCl group,but in the sixth week the expression of MMP-3 in NaCl group increased(P<0.05).IL-18 injected into the intervertebral discs can lead to decline of aggrecan and morphologicaL changes in the nucleus pulposus,which were related with dose of IL-18 adminstration.

Key words:interleukin-18;intervertebral disc;aggrecan;matrix metalloproteinase-3

椎間盤退變是引起下腰痛、腰腿痛及腰椎間盤突出癥的病理學(xué)基礎(chǔ),目前的研究發(fā)現(xiàn),炎性細(xì)胞因子在椎間盤退變的過程中發(fā)揮極其重要的作用[1]。IL-18是目前研究較多的炎性細(xì)胞之一,在炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)等疾病中扮演重要角色[2]。隨著醫(yī)學(xué)分子學(xué)和病理學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,研究發(fā)現(xiàn),其在退變的椎間盤組織中表達(dá)明顯增多,且能誘導(dǎo)前列腺素 E2生成,刺激軟骨細(xì)胞合成一氧化氮(NO)合酶,加速椎間盤病變惡化[3]。因此,我們選擇健康大白兔,采用髓核內(nèi)注射IL-18來觀察其對(duì)椎間盤組織的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹苽浜头纸M

健康大白兔72只,雌雄各半,年齡4～6個(gè)月,體重2.5～3.0 kg,(由石河子大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。IL-18由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。隨機(jī)選取48只作為實(shí)驗(yàn)組,16只作為陰性對(duì)照組,8只作為空白對(duì)照組。麻醉成功后,動(dòng)物俯臥位固定于兔臺(tái),背部備皮,采用腰椎側(cè)方倒八字入路,切開皮膚及皮下組織,分離腹肌于腹膜外進(jìn)入腰椎側(cè)方,找到L4～L5椎體,咬除部分橫突,顯露顏色呈白色的L4～L5椎間盤。實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分為3組,每組16只,用1μL的微量注射器分別注入 I L-18 10 ng/μL(實(shí)驗(yàn) A 組)、IL-18 20 ng/μL(實(shí)驗(yàn) A 組)、IL-18 40 ng/μL(實(shí)驗(yàn)C組)各1μL 到L4～L5椎間盤髓核內(nèi)。陰性對(duì)照組(生理鹽水組)選擇L4～L5椎間盤內(nèi)注射1μL的生理鹽水?？瞻讓?duì)照組選擇L4～L5椎間盤不作任何處理。注射椎間盤節(jié)段采用黑色縫合線作標(biāo)記。以上各組,術(shù)后傷口無菌包扎,常規(guī)應(yīng)用青霉素肌注,每天每公斤體重20萬單位。連續(xù)注射10 d。術(shù)后兩周拆除皮膚縫線。常規(guī)飼養(yǎng),分別于第3、6周時(shí)各取8只兔子經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞處死,經(jīng)左腹前外側(cè)入路(手術(shù)方法同前)取出L4～L5椎間盤。將取出的每個(gè)椎間盤組織分為兩份。一份中性甲醛固定24h,另一份快速液氮冰凍保存。

1.2 組織形態(tài)學(xué)觀察

將標(biāo)本置于10%中性福爾馬林液固定48 h,在Schmorl氏脫鈣液中脫鈣24 h以上,至完全脫鈣,流水沖洗24 h,逐級(jí)脫水和浸蠟,石蠟包埋,切制5 μm石蠟切片,HE染色,光鏡下觀察。

1.3 蛋白多聚糖含量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)采用以朱慶三等[4]所述Bitter法進(jìn)行蛋白多聚糖含量的測(cè)量。將液氮保存的每組取出的8個(gè)髓核置20 mL試管中,加丙酮2次,各6 h棄去,乙醚脫脂過夜后,置50℃恒溫箱干燥4 h;稱取脫脂髓核5 mg置10 mL試管中,加入木瓜酶消化液0.5 mL在60℃消化7 h(每2 h攪拌一次)冷卻至室溫加入30%TCA 0.25 mL,室溫放置2 h,3500 r/min離心5 min。取50μL上清樣本溶液,加蒸餾水2 mL。在有塞試管內(nèi)加入濃硫酸3 mL,冰水浴至4℃左右。取樣本或標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖醛酸溶液1 mL加入試管中冰水浴冷卻。將試管置沸水中加熱10 min,冷卻后加入咔唑試劑(0.125 g咔唑溶于100 mL乙醇)0.2 mL。再次沸水浴15 min,冷卻后530 nm處測(cè)定OD值。線性回歸分析得到吸光度與標(biāo)準(zhǔn)糖醛酸濃度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線,再根據(jù)樣本溶液OD值計(jì)算蛋白多聚糖含量。

1.4 MMP-3免疫組織化學(xué)檢測(cè)

應(yīng)用免疫組織化學(xué)SABC法檢測(cè)椎間盤組織中MMP-3的表達(dá)。MMP-3多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,一抗按1∶400稀釋。免疫組織化學(xué)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。免疫組織化學(xué)陽性對(duì)照為用含MMP-3豐富的乳腺癌病理切片代替實(shí)驗(yàn)切片,實(shí)驗(yàn)步驟相同,制備免疫組化陽性對(duì)照,結(jié)果為陽性。陰性對(duì)照為實(shí)驗(yàn)時(shí)不加抗MMP-3的多克隆抗體。顯微鏡下觀察,免疫組織化學(xué)陽性染色為細(xì)胞漿內(nèi)棕黃色顆粒,根據(jù)染色強(qiáng)度分為以下4個(gè)等級(jí):-,無陽性細(xì)胞;+,陽性細(xì)胞 < 30%;++,陽性細(xì)胞占 3 0%～60%;+++,陽性細(xì)胞>60%。

1.5 資料收集和數(shù)據(jù)處理

各組數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,采用統(tǒng)計(jì)軟件數(shù)據(jù)包SPSS11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。多組數(shù)據(jù)之間均數(shù)比較采用單因素方差分析,然后采用LSD法行兩兩比較,兩組數(shù)據(jù)之間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學(xué)結(jié)果

HE染色顯示:空白組及陰性對(duì)照組纖維環(huán)仍保持著致密的板層結(jié)構(gòu),細(xì)胞成分較多,呈梭形纖維細(xì)胞樣或呈軟骨細(xì)胞樣。而實(shí)驗(yàn)組隨著IL-18劑量增加及時(shí)間延長:髄核脊索細(xì)胞逐漸減少,并逐漸被纖維軟骨細(xì)胞替代,纖維環(huán)與髄核之間失去明顯的界限。且在實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較顯示了更多的髓核毛細(xì)血管侵入和炎性細(xì)胞浸潤,髓核及纖維環(huán)退變更嚴(yán)重,纖維細(xì)胞增生及瘢痕形成,見圖1。

2.2 蛋白多聚糖含量

各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組蛋白多聚糖含量較正常對(duì)照組顯著下降。從量效關(guān)系來看,C組蛋白多聚糖含量下降高于B組,B組蛋白多聚糖含量下降高于A組;從時(shí)效關(guān)系來看各實(shí)驗(yàn)組蛋白多聚糖含量下降值6周高于3周,見表1。

表1 髓核蛋白多聚糖含量的測(cè)定Tab.1 Results of nucleus pulposus proteoglycan content x±Sμ,g/mg

圖1 各組兔椎間盤組織HE染色顯微鏡觀察照片(100×)Fig.1 HE-staining results of each group rabbit lumbar intervertebral disc(100×)

2.3 MMP-3免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

MMP-3陽性結(jié)果表現(xiàn)為:細(xì)胞漿內(nèi)有黃色或棕黃色顆粒。每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)視野并記錄陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù),該標(biāo)本陽性細(xì)胞率=10個(gè)視野(×400)×視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)÷10個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)×100%,陽性細(xì)胞率<5%為陰性。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組陽性表達(dá)情況,實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組,且隨著IL-18劑量增加及時(shí)間延長,實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加,見表2。各組兔椎間盤組織MMP-3免疫組化染色顯微鏡觀察照片,見圖2。

表2 MMP-3免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Results of immunohistochemistry of MMP-3μ,g/mg

表2 MMP-3免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Results of immunohistochemistry of MMP-3μ,g/mg

注:與空白對(duì)照組比較:＊表示 P<0.05;與陰性對(duì)照組比較:Δ表示 P<0.05。同組不同時(shí)間比較用t檢驗(yàn)。

組別 n 時(shí) 間3周 6周t P空白對(duì)照組 8 2.075±0.354 2.075±0.354 — —陰性對(duì)照組 8 2.125±0.238 5.020±0.627＊16.713 <0.05實(shí)驗(yàn)A組 8 11.7±0.956＊Δ20.175±1.123＊Δ21.499 <0.05實(shí)驗(yàn)B組 8 20.375±0.916＊Δ30.225±1.949＊Δ17.114 <0.05實(shí)驗(yàn) C組 8 30.575±1.017＊Δ41.400±1.792＊Δ19.657 <0.05 F 2027.568 1260.154 P<0.05 <0.05

圖2 各組兔椎間盤組織MMP-3免疫組化染色顯微鏡觀察照片(400×)Fig.2 MMP-3 immunohistochemistry coloured results of each group rabbit lumbar intervertebral disc(400×)

3 討論

IL-18主要由活化的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,有許多生物學(xué)活性,刺激 T細(xì)胞增殖;誘導(dǎo) T細(xì)胞和自然殺傷(N K)細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ;使 T細(xì)胞分泌 IL-2、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和腫瘤壞死因子(TNF-α);促進(jìn) T細(xì)胞、N K細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化成熟,增強(qiáng)N K細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[2]。誘導(dǎo) T細(xì)胞和N K細(xì)胞表達(dá) Fas配體(FasL)等。除此之外,IL-18還對(duì) IL-8、單核細(xì)胞炎癥蛋白1(MIP-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)等趨化蛋白都有作用[5],而這些炎性因子反過來又促進(jìn)IL-18合成,從而形成正反饋,加重反應(yīng),使椎間盤內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)一步減少,從而加速了退變過程。椎間盤主要由膠原、蛋白多糖、彈性纖維、非膠原蛋白、糖蛋白等組成。其中,膠原和蛋白多糖是基質(zhì)的主要成分,其含量和成分改變被認(rèn)為是椎間盤退變最早出現(xiàn)的生化改變之一,并可直接導(dǎo)致椎間盤生物力學(xué)性能的改變,隨著年齡的增長,蛋白多糖的總量及糖胺多糖顯著減少[6],使膠原結(jié)構(gòu)變得脆弱,造成生物力學(xué)功能障礙,引起椎間盤退行性變。其中MMP-3是降解椎間盤組織中蛋白多糖聚合體及椎間盤內(nèi)多種基質(zhì)成分的主要酶,減少髓核的親水作用。通過降解連接蛋白破壞核心蛋白的透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)分解蛋白多糖聚合體,此外還可以降解多種膠原、層粘素、纖維連接素、明膠、基底膜和結(jié)締組織,并且可以通過激活其他MMPs起作用[7]。

最近的研究顯示,在人體退變的椎間盤組織中發(fā)現(xiàn)IL-18高表達(dá),認(rèn)為 IL-18參與了這個(gè)過程,并認(rèn)為是引起其退變的關(guān)鍵因子[8],但其引起椎間盤退變的機(jī)制鮮為人知,有關(guān)這方面的研究也少有報(bào)道。本研究以家兔為動(dòng)物模型,通過向髓核內(nèi)注射不同劑量的IL-18,在不同的時(shí)間點(diǎn)觀察其對(duì)椎間盤蛋白多聚糖的影響并進(jìn)行MMP-3免疫組織化學(xué)檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:從形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),空白組及陰性對(duì)照組纖維環(huán)仍保持著致密的板層結(jié)構(gòu),纖維排列整齊,細(xì)胞成分較多,呈梭形纖維細(xì)胞樣或呈軟骨細(xì)胞樣。而實(shí)驗(yàn)組隨著IL-18劑量增加及時(shí)間延長:纖維結(jié)構(gòu)排列紊亂,髄核脊索細(xì)胞逐漸減少,并逐漸被纖維軟骨細(xì)胞替代,纖維環(huán)與髄核之間失去明顯的界限。且在實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較顯示了更多的髓核毛細(xì)血管侵入,髓核及纖維環(huán)退變更嚴(yán)重,纖維細(xì)胞增生及瘢痕形成。3周時(shí)陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組髓核蛋白多聚糖沒有明顯變化,6周時(shí)陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組髓核蛋白多聚糖比較有差異性(P<0.05),而實(shí)驗(yàn)組蛋白多聚糖含量下降明顯(15.72%～43.78%,P<0.001),并且下降程度與 IL-18注射劑量呈正相關(guān)(P<0.01),表明椎間盤在IL-18的作用下蛋白多聚糖降解加劇或者合成明顯減少,并且和劑量呈正相關(guān)。而病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組均有表達(dá)MMP-3的陽性細(xì)胞,且隨時(shí)間延長陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多,并且陽性率與IL-18注射劑量呈正相關(guān)(P<0.01)。陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組在3周時(shí)很少發(fā)現(xiàn)表達(dá)MMP-3的陽性細(xì)胞,而6周時(shí),陰性對(duì)照組表達(dá)MMP-3的陽性細(xì)胞較空白對(duì)照組表達(dá)增多(P<0.05),這與陰性對(duì)照組六周時(shí)蛋白多糖的降低一致,但沒有實(shí)驗(yàn)組增多明顯,進(jìn)一步說明IL-18加速了椎間盤的退變過程,而IL-18是否直接促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)尚不能定論,需進(jìn)一步的研究。

本組實(shí)驗(yàn)研究表明,小劑量 IL-18注射短期內(nèi)就可以引起蛋白多聚糖含量的明顯下降,在某種程度上說明了IL-18可以通過影響蛋白多聚糖含量的變化來導(dǎo)致椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變,從而加速了椎間盤的退變,為臨床通過抑制IL-18的作用來延緩椎間盤退變提供了一定的理論基礎(chǔ)。但是,IL-18與椎間盤內(nèi)其它炎性因子以及各種水解酶系相互間的作用,亦不甚清楚,如何通過改變 IL-18與其它炎性細(xì)胞因子以及各種水解酶的相互作用來達(dá)到預(yù)防和治療椎間盤病變需更進(jìn)一步的研究。

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Effects of Interleukin-18 on the Degeneration of Rabbit Lumbar Intervertebral Disc

CHEN Cao,QIN Chao,LIU Weigang,WANG Weishan,DONGJinbo,SHI Chenhui
(1 The First Affiliated Hospital of Medical College,Shihezi University,Shihezi 832002,China;2 The Second Affiliated Hopspital of Medical College,Shihezi Univevsity,Wulumuqi 810000,China)

R681.53

A

1007-7383(2010)05-0587-05

2009-12-17

陳操(1983-),男,碩士生,專業(yè)方向?yàn)榧怪饪啤?/p>

劉維鋼(1963-),男,教授,主任醫(yī)師,從事脊柱與骨組織工程的研究;e-mail:Liu-wg@163.com 。