賈玉臣，陳慶森*，王友湘，閻亞麗

(天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134)

瑞士乳桿菌對小鼠腸道黏膜免疫應(yīng)答及細(xì)胞因子的影響

賈玉臣，陳慶森*，王友湘，閻亞麗

(天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134)

探討灌胃瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus TS206)發(fā)酵制品對健康Balb/c小鼠腸道黏膜免疫應(yīng)答及細(xì)胞因子的影響。本實驗將Balb/c小鼠分為空白對照組、生理鹽水組和瑞士乳桿菌組3組，瑞士乳桿菌組的灌胃劑量為108CFU/mL，分別在灌胃后0、1、2、3、4、6、8、12、24h處死小鼠得到小腸組織樣品，利用RIA法和ELISA法測得各組小鼠腸道黏膜SIgA和細(xì)胞因子的含量，并作統(tǒng)計分析。結(jié)論：灌胃組小鼠腸道黏膜中SIgA的含量與生理鹽水對照組相比差異極顯著(P＜0.01)；灌胃組小鼠腸道黏膜中IL-2和IFN-γ的含量與生理鹽水對照組相比具有顯著性差異(P＜0.05)；灌胃組IL-4與生理鹽水對照組相比含量明顯升高(P＜0.05)；而灌胃組和生理鹽水對照組相比IL-6的表達(dá)水平后期差異不顯著(P＞0.05)；IFN-γ/IL-4的值處于相互拮抗的狀況，表明瑞士乳桿菌對健康小鼠具有維護(hù)腸黏膜免疫平衡的作用，也對保持Th1/Th2平衡狀態(tài)具有明顯的作用，即證實瑞士乳桿菌作為益生菌具有調(diào)控小鼠腸道黏膜免疫應(yīng)答的功效。

瑞士乳桿菌；細(xì)胞因子；腸道黏膜；免疫應(yīng)答

腸黏膜中細(xì)胞因子是由腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells，IECs)、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌能影響其他細(xì)胞功能的多肽分子。它們表達(dá)于天然免疫和特異免疫的效應(yīng)階段，介導(dǎo)免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)并進(jìn)行調(diào)節(jié)[1]。IFN-γ為Th1最特異分泌的細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能，清除細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌和病毒的作用；IL-4為Th2最特異分泌的細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)體液免疫功能，可中和細(xì)胞外的病原體。腸黏膜上皮細(xì)胞受到刺激后，若IL-4在外周血及腸黏膜組織中水平升高，而IFN-γ分泌水平下降，從而使IFN-γ/IL-4比值變化，導(dǎo)致Th1/Th2失衡[2]。機體在對抗自身及外來抗原入侵的過程中以Th1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主，一旦由Th1向Th2偏移，則機體處于免疫抑制狀態(tài)，使腸黏膜逃避免疫監(jiān)視。

瑞士乳桿菌TS206(Lactobacillus helveticus TS206)不僅是人體腸道的益生菌，而且還具有較強的蛋白水解活性，能水解乳蛋白產(chǎn)生多種生物活性肽，如該菌發(fā)酵產(chǎn)ACE抑制活性肽已表現(xiàn)出很好的開發(fā)潛力[3]；能夠促進(jìn)小鼠腸道內(nèi)有益菌的顯著增殖，同時對腸道內(nèi)過路菌和可疑致病菌均有一定的抑制作用，從而對小鼠腸道微生物區(qū)系具有一定的調(diào)節(jié)作用[4]。早在1988年de Simone 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，腸胃外給予乳酸菌能誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF、IL-2以及IL-1，并且存在菌株差異性。Perdigon等[6]通過灌喂乳酸菌或乳酸菌發(fā)酵奶后再經(jīng)口導(dǎo)入沙門氏菌，發(fā)現(xiàn)乳酸菌能通過在腸液中產(chǎn)生抗沙門氏菌的IgA(免疫球蛋白A)起到免疫保護(hù)作用，血清IgA 水平也顯著高于灌喂牛奶的大鼠，且這種作用也有菌株差異性。曹晉宜等[7]、王友湘等[8]研究證實，長期灌胃一定劑量的瑞士乳桿菌具有顯著提高腸黏膜的免疫調(diào)控功能。本研究以具有益生功能的瑞士乳桿菌TS206灌胃 Balb/c小鼠，利用RIA和ELISA法測定各組小鼠腸道黏膜SIgA和細(xì)胞因子的含量，探討瑞士乳桿菌在調(diào)節(jié)動物腸道黏膜免疫功能方面的作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

瑞士乳桿菌TS206 (Lactobacillus helveticus TS206)，本實驗室保藏菌種。

Balb/c小鼠(SPF級，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量16～20g)和小鼠常規(guī)飼料均購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。

分泌型免疫球蛋白A放射免疫分析試劑盒(SIgA RIA Kit) 中國原子能科學(xué)研究院同位素研究所；細(xì)胞因子定量檢測試劑盒 北京尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

高壓蒸汽滅菌鍋、超低溫冰箱 Sanyo公司；恒溫生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機 Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 瑞士乳桿菌TS206的發(fā)酵工藝

質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%乳清粉溶液，調(diào)pH5.5→115℃高壓滅菌30min→低速離心除去雜質(zhì)→115℃高壓滅菌→接種瑞士乳桿菌→40℃下靜止培養(yǎng)16h→終止發(fā)酵，獲得菌體細(xì)胞

1.2.2 灌胃瑞士乳桿菌細(xì)胞制劑的制備

將發(fā)酵獲得的瑞士乳桿菌菌體細(xì)胞用無菌生理鹽水懸浮，在600nm波長處測定菌懸液的OD值，同時用溴甲酚綠培養(yǎng)基平板計數(shù)[9]，作出菌落數(shù)-OD值的關(guān)系曲線，利用該曲線將菌濃濃調(diào)整至108CFU/mL備用。

1.2.3 實驗動物分組

本研究設(shè)計的短期內(nèi)(24h)灌胃Balb/c小鼠瑞士乳桿菌細(xì)胞制劑的最佳劑量按文獻(xiàn)[7-8]進(jìn)行，試驗設(shè)計方案及灌胃方式見表1所示。

表1 實驗動物分組及灌胃方案Table 1 Grouping mice and the dose received respectively

1.2.4 腸黏膜及組織樣本的獲取

實驗按表1所設(shè)計的菌濃度灌胃小鼠，分別在灌胃后0、1、2、3、4、6、8、12、2 4 h處死小鼠(每組3只)，解剖得到小腸組織，用無菌緩沖液沖洗除掉殘渣后刮取內(nèi)容物0.1g于離心管中， －20℃下冷凍保藏；同時取小鼠自幽門下4cm處小腸0.15g于離心管中，－20℃下冷凍保藏。待所有樣品收集完后在檢測前要進(jìn)行樣品的預(yù)處理。

1.2.5 小鼠腸道黏膜中SIgA含量的測定

將腸黏膜樣品取出平衡至室溫，然后加入無菌pH7.2的PBS緩沖液200μL充分搖勻，2000×g離心10min，取上清液100μL 進(jìn)行放射性免疫法(radioimmunoassay，RIA)檢測，操作步驟按說明書進(jìn)行。測定值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各個樣品中SIgA的含量。

1.2.6 小鼠腸道黏膜中細(xì)胞因子含量的測定

將小腸組織樣品取出平衡至室溫，然后加入無菌pH7.2的PBS緩沖液500μL，在4℃下用組織勻漿器將組織破碎，立即在離心機中4℃、5000×g離心10min，取上清液分裝到4個離心管中，每個離心管放100μL，放回到4℃冰箱中保存待測。用ELISA方法按照試劑盒說明書所述步驟進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 灌胃瑞士乳桿菌對小鼠腸黏膜SIgA含量的影響

圖1 灌胃瑞士乳桿菌對小鼠腸道黏膜SIgA含量的影響Fig.1 Effect of Lactobacillus helveticus by oral administration on the content of SIgA in intestinal mucosa of mice

圖1表明，24h內(nèi)生理鹽水對照組腸黏膜中SIgA的含量處于平穩(wěn)的分泌水平，瑞士乳桿菌灌胃組小鼠腸道黏膜中SIgA的含量與生理鹽水對照組相比，在1h呈現(xiàn)極顯著差異(P＜0.01)，此后波動性升高并于12h后基本維持在一個顯著的較高水平(P＜0.05)?？梢?，瑞士乳桿菌作為益生菌對小鼠腸黏膜具有明顯免疫調(diào)節(jié)作用，與前期報道是一致的，即通過對灌胃瑞士乳桿菌和大腸桿菌小鼠腸道微生物菌群的比較，證實了瑞士乳桿菌具有促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸桿菌增殖的作用，對腸桿菌和腸球菌等條件致病菌的生長有一定的抑制作用，能夠降低腸道內(nèi)大腸桿菌的數(shù)量[4,8]。實驗表明，一定劑量(≥106CFU/mL)的瑞士乳桿菌對動物腸道的內(nèi)環(huán)境具有很好的調(diào)理作用。

2.2 灌胃瑞士乳桿菌對小鼠腸黏膜Th1/Th2平衡的影響

2.2.1 灌胃瑞士乳桿菌對小鼠腸黏膜Th1細(xì)胞因子的影響

圖2表明，瑞士乳桿菌灌胃組小鼠腸道黏膜中IL-2的含量和生理鹽水對照組相比，從第1小時便呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)，在前8h瑞士乳桿菌灌胃組小鼠腸黏膜中IL-2的波動比較大，在第4小時和第6小時呈現(xiàn)極顯著升高(P＜0.01)，于第6小時達(dá)到最大值(1044.92pg/g內(nèi)容物)，在12～24h時間段內(nèi)波動比較緩慢，但明顯比生理鹽水對照組高；對于IFN-γ，由圖3可見，瑞士乳桿菌灌胃組小鼠腸黏膜中IFN-γ含量與生理鹽水對照組相比，除了在第4小時無顯著差異外(P＞0.05)，其他時間點均呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)，并于第3小時達(dá)到最大值(519.81 pg/g內(nèi)容物)整體變化趨勢與IL-2相似。

圖2 灌胃瑞士乳桿菌對小鼠腸黏膜IL-2含量的影響Fig.2 Effect of Lactobacillus helveticus by oral administration on the content of IL-2 in intestinal mucosa

圖3 灌胃瑞士乳桿菌對小鼠腸黏膜IFN-γ含量的影響Fig.3 Effect of Lactobacillus helveticus by oral administration on the content of IFN-γ in intestinal mucosa of mice

2.2.2 灌胃瑞士乳桿菌對小鼠腸黏膜Th2細(xì)胞因子的影響

圖4 灌胃瑞士乳桿菌對小鼠腸黏膜IL-4含量的影響Fig.4 Effect of Lactobacillus helveticus by oral administration on the content of IL-4 in intestinal mucosa of mice

圖5 灌胃瑞士乳桿菌對小鼠腸黏膜IL-6含量的影響Fig.5 Effect of Lactobacillus helveticus by oral administration on the content of IL-6 in intestinal mucosa of mice

圖4表明，瑞士乳桿菌灌胃組小鼠腸道黏膜中IL-4的含量和生理鹽水對照組相比，除在第2、3、4小時無顯著差異外(P＞0.05)，其他時間點均顯著升高(P＜0.05)，至6h前瑞士乳桿菌灌胃組小鼠腸道黏膜中IL-4的含量有所下降，但是在6h后表達(dá)水平又較明顯地升高，說明一定劑量的瑞士乳桿菌對健康小鼠腸黏膜具有一定的拮抗調(diào)節(jié)作用，長期灌胃瑞士乳桿菌對腸道黏膜刺激表達(dá)IL-4的水平也證實了這種現(xiàn)象[7]。

由圖5可見，瑞士乳桿菌灌胃組小鼠腸道黏膜中IL-6的含量和生理鹽水對照組相比在前期波動較大，第1小時和第6小時均呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)，并于第6小時達(dá)到最大值(628.88pg/g內(nèi)容物)，在后期處于比較平緩的狀態(tài)，與生理鹽水對照組相比差異不顯著(P＞0.05)。瑞士乳桿菌刺激后IL-6的分泌情況與長期灌胃益生菌組小鼠腸道黏膜中IL-6的含量具有相類似的情況[7]。

2.2.3 灌胃瑞士乳桿菌對小鼠腸黏膜IFN-γ/IL-4比值的影響

圖6 灌胃瑞士乳桿菌對小鼠腸黏膜IFN-γ/IL-4比值的影響Fig.6 Effect of Lactobacillus helveticus by oral administration on the ratio of IFN-γ/IL-4 in intestinal mucosa of mice

對Th1型和Th2型細(xì)胞比例的分析結(jié)果如圖6所示，瑞士乳桿菌組的IFN-γ/IL-4比值與生理鹽水對照組相比，在第3小時差異顯著(P＜0.05)，隨后第4小時和第6小時又表現(xiàn)為差異不顯著(P＞0.05)，并在第12小時呈現(xiàn)極顯著的升高(298.46)，后期急劇下降，但與生理鹽水對照組相比差異顯著(P＜0.05)。這說明了IFN-γ是Th1型的細(xì)胞因子，當(dāng)Th2型細(xì)胞因子增多時Th1細(xì)胞因子也要增多以抑制Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)機體的平衡?？梢?，短時間的灌胃并不能完全反映瑞士乳桿菌以及益生菌的調(diào)節(jié)作用，長期灌胃更能正確地反映益生菌效用價值。

3 討 論

分泌型IgA (SIgA)是機體內(nèi)腸黏膜表面分泌的主要免疫球蛋白，也是防御致病菌在腸道黏膜黏附和定植的第一道防線。機體黏膜B細(xì)胞通過免疫受體和微生物抗原的交互作用，特異性的移到生發(fā)中心，SIgA漿細(xì)胞在黏膜淋巴濾胞中發(fā)育，均沿上皮層分布，彌散定居于黏膜下層各位點。有些細(xì)胞因子可調(diào)節(jié)SIgA的表達(dá)，如IL-4和TGF-β促進(jìn)B細(xì)胞發(fā)生IgA類型轉(zhuǎn)換，IFN-γ通過拮抗IL-4 抑制IgA抗體的分泌。Th2型細(xì)胞因子IL-5、IL-6和IL-10可促進(jìn)IgA的分泌。本研究證實了灌胃瑞士乳桿菌TS206對腸黏膜高水平分泌SIgA起到了顯著的促進(jìn)作用，這可能是由于瑞士乳桿菌有效地通過受體競爭作用使黏膜的分泌，或者是誘導(dǎo)腸道淋巴組織的免疫功能來保護(hù)黏膜的[10]。另外，瑞士乳桿菌對腸黏膜的保護(hù)可能主要歸功于“定殖障礙”。“定殖障礙”是描述某些細(xì)菌抑制其他種類細(xì)菌定殖的作用，如營養(yǎng)和復(fù)位點的競爭，改變環(huán)境的pH值，產(chǎn)生細(xì)菌素或其他抗菌肽等。這種定殖構(gòu)成了一種強烈的黏膜屏障功能，從而防止致病菌的吸附和入侵。眾多的研究報道表明益生菌能夠通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對機體的天然和獲得性免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，抑制異常的自身免疫反應(yīng)，維持腸道穩(wěn)態(tài)[4-8]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，大大推動了促炎性細(xì)胞因子與抗炎性細(xì)胞因子的研究，特別對炎癥性腸病(IBD)的發(fā)病機制的研究和相關(guān)腸道疾病的治療進(jìn)展[11-12]，Th1/Th2平衡理論已為解釋一些自身免疫性疾病提供了很好的模型。Th細(xì)胞根據(jù)CD4+細(xì)胞分泌的兩類不同細(xì)胞因子分為Th1和Th2細(xì)胞，Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ等，而Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-10等。Th1/Th2細(xì)胞具有相互拮抗作用，通過阻止另一類細(xì)胞的產(chǎn)生效應(yīng)功能以實現(xiàn)影響Th1/Th2細(xì)胞間的平衡，IFN-γ能促進(jìn)Th2細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，影響Th1/Th2比率，而IL-4能促進(jìn)Th0細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，并抑制Th1細(xì)胞，分泌其系列因子，促進(jìn)機體免疫應(yīng)答。Th1細(xì)胞主要介導(dǎo)與細(xì)胞和局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答，參與細(xì)胞免疫；而Th2細(xì)胞的主要功能為刺激及細(xì)胞增生并產(chǎn)生抗體與體液免疫有關(guān)。機體要處于良好的免疫狀態(tài)，應(yīng)保持Th1/Th平衡，才能使機體不處于免疫抑制狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示IL-2和IL-6在第6小時達(dá)到最高點；IL-4在第1小時達(dá)到最高點；IFN-γ在第3h達(dá)到最高值，表明Th1/Th2細(xì)胞處于相互拮抗?fàn)顟B(tài)；IFN-γ/IL-4值在第3小時達(dá)到最高點，此后開始呈波動式下降，在第24小時降至和灌胃前的水平比較接近的狀態(tài)。因此，實驗結(jié)果表明灌胃一定劑量的瑞士乳桿菌對腸黏膜細(xì)胞因子的表達(dá)是一種上調(diào)的趨勢，細(xì)胞因子的變化比較快速，在短期內(nèi)就能達(dá)到較高的水平，處于平緩期的水平也是高于對照組的，不是無限增加的，而是在調(diào)節(jié)機體平衡的同時細(xì)胞因子趨于一定的水平，短期內(nèi)的瑞士乳桿菌的刺激使細(xì)胞因子明顯增多但是波動較大，沒有長期灌胃時表現(xiàn)出較好的規(guī)律性。但研究也明顯地表明了刺激在12h后細(xì)胞因子會慢慢趨向于一個比較恒定的水平，最終保持Th1型和Th2型T細(xì)胞逐漸趨于正常比例，達(dá)到維持機體的健康。

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Effects of Lactobacillus helveticus on Immune Response and Cytokines in Intestinal Mucosa of Mice

JIA Yu-chen，CHEN Qing-sen*，WANG You-xiang，YAN Ya-li
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134, China)

Our aim was to investigate the effects of Lactobacillus helveticus TS206 on intestinal immune response and cytokines in intestinal mucosa of healthy Balb/c mice. Mice were randomly assigned to three groups - normal control group, saline control group and L.helveticus group which were administered with the dose 108CFU/mL. All the mice were executed after 0, 1, 2, 3, 4,6, 8, 12, 24 h of administration and the SIgA and cytokines concentration were determined in intestine mucosa of all mice by radioimmunoassay (RIA) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The results showed that compared with control group and physiological saline group, the SIgA content in intestinal mucosa of mice with the oral administration of L. helveticus was significant different (P＜0.01); IL-2 and IFN-γ content was also significant different (P＜0.05). IL-4 content in the intestinal mucosa of mice from treatment was significantly higher than control (P＜0.05), but not IL-6 expression level (P＞0.05). IFN-γ/IL-4 ratio exerted mutual antagonistic action, suggesting that L. helveticus maintain mucosa immunization balance in healthy mice,and also keep Th1/Th2 balance. Our results indicate that probiotic bacteria L.helveticus is provided with modulation of immune response in intestinal mucosa of mice.

Lactobacillus helveticus；cytokine；intestinal mucosa；mmune response

TS201.3

A

1002-6630(2010)23-0335-05

2010-09-20

國家自然科學(xué)基金項目(30771524；31071522)

賈玉臣(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵生物技術(shù)、乳品質(zhì)量與安全。E-mail：jychtotti@163.com

陳慶森(19 57—)，男，教授，碩士，研究方向為發(fā)酵生物技術(shù)、生物活性物質(zhì)。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn