王 雙，王昌濤*，韓 揚(yáng)

(1.北京工商大學(xué) 植物資源研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

燕麥ACE抑制肽的分離純化及其活性研究

王 雙1,2，王昌濤1,*，韓 揚(yáng)1

(1.北京工商大學(xué) 植物資源研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

通過(guò)對(duì)3種大孔吸附樹(shù)脂的比較，選擇DA201-C樹(shù)脂對(duì)燕麥ACE抑制肽進(jìn)行純化。純化后的燕麥肽產(chǎn)物的ACE抑制率達(dá)到92.86%，利用HPLC測(cè)得純化后燕麥ACE抑制肽的分子質(zhì)量分布在240.10～1292.11D之間，這部分物質(zhì)在整個(gè)純化產(chǎn)物中占99.82%。采用SephadexG-15凝膠分離燕麥ACE抑制肽得到D峰，其IC50為0.103mg/mL，分子質(zhì)量545D。采用大孔吸附樹(shù)脂及凝膠層析法能夠較好地分離純化燕麥ACE抑制肽。

燕麥；ACE抑制肽；大孔吸附樹(shù)脂；凝膠層析

燕麥?zhǔn)枪阮?lèi)食品中最好的全價(jià)營(yíng)養(yǎng)食品之一，它富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素及膳食纖維等現(xiàn)代食品營(yíng)養(yǎng)素，具有多種保健功效[1]。ACE是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶，它在人體中廣泛存在[2-3]，具有收縮血管的作用，可引起血壓升高，而食品蛋白來(lái)源的ACE抑制肽可以通過(guò)與ACE結(jié)合，從而起到降壓作用[4-5]。到目前為止所有報(bào)道的ACE抑制肽多為2～15肽，其分子質(zhì)量在200～1500D之間[6]，關(guān)于燕麥ACE抑制肽的研究目前大多集中于提取工藝的優(yōu)化，而分離純化的相關(guān)報(bào)道較為少見(jiàn)且研究不夠深入，同時(shí)缺少關(guān)于純化產(chǎn)物活性的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)以燕麥為植物蛋白源，采用超聲輔助酶法制備ACE活性肽，然后應(yīng)用大孔吸附樹(shù)脂及凝膠層析法對(duì)燕麥ACE抑制肽進(jìn)行分離純化，去除雜質(zhì)，并測(cè)定純化后產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布狀態(tài)及純化前后ACE抑制活性的變化，旨在為燕麥ACE抑制肽的研究與開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕麥麩皮 河北省張家口農(nóng)科院燕麥研究所；Angiotensin converting enzyme(ACE)(活力 0.1U/mg)、N-hippuryl-his-leu hydrate(HHL) Sigma公司；堿性蛋白酶(3AU/g) 丹麥諾維信酶制劑公司；大孔吸附樹(shù)脂(DA201-C) 江蘇省江陰市有機(jī)化工廠；Amberlite(XAD1600)樹(shù)脂、Amberlite(XAD7HP)樹(shù)脂 北京慧德易公司；牛血清蛋白、VB12、氧化性谷胱甘肽 北京拜爾迪生物公司；乙腈(色譜純)、三氟乙酸(色譜純)Fisher公司；SephadexG-15 Fine Pharmacia公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JXD-02型超聲波電源(28、40、50、135kHz) 北京金星超聲波設(shè)備技術(shù)有限公司；DCW-3506型低溫恒溫槽 寧波新芝生物科技股份有限公司；DSHZ-300型水浴恒溫振蕩器 江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(T6新世紀(jì)) 北京普析通用儀器有限公司；ALPHA2-4/LSC型冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；KDN-2C型定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；柱層析系統(tǒng)(大孔樹(shù)脂用層析柱(φ2.5cm×60cm)、DHL-A電腦恒流泵、DBS-100電腦全自動(dòng)部分收集器) 上海滬西儀器廠有限公司；L-8900氨基酸分析儀 日本Hitachi公司；高效液相色譜儀 美國(guó)Waters科技有限公司；凝膠層析系統(tǒng)(層析柱φ 1.5cm×60cm、DHL-A電腦恒流泵、DBS-100電腦全自動(dòng)部分收集器、IHID-2核酸蛋白檢測(cè)儀記錄儀) 上海滬西儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲波輔助酶法制備燕麥ACE抑制肽

稱(chēng)取一定量燕麥麩皮(20～60目過(guò)篩，粒徑在0.250～0.850mm間)，按料水比1:10(g/mL)配制，放入塑料杯容器中，用1mol/L NaOH將燕麥麩皮液調(diào)pH11，利用超聲波對(duì)燕麥麩皮液進(jìn)行預(yù)處理28.4min[7](水浴溫度55.05℃，超聲波頻率50kHz，超聲波功率190.08W)，測(cè)定pH值(測(cè)定值為8.2，與Alcalase酶反應(yīng)的最適pH值基本一致)，之后直接按酶與底物比(E/S)5%添加Alcalase酶，繼續(xù)在水浴中反應(yīng)2.25h[7]，隨后在85℃條件滅酶10min。之后在12000r/min離心5min，所得上清液(盡量除去離心液表面的油脂)進(jìn)行抽濾，所得酶解液進(jìn)行冷凍干燥，備用。

1.3.2 檢測(cè)方法

固體蛋白含量的測(cè)定方法：采用凱氏定氮法測(cè)定固體蛋白含量；多肽含量的測(cè)定方法[8]：采用Folin-酚法測(cè)定多肽含量；ACE抑制活性體外檢測(cè)方法[9-10]：馬尿酸法測(cè)定ACE體外抑制活性；水分含量的測(cè)定方法：采用105℃質(zhì)量恒定法(GB5497—85《糧食、油料檢驗(yàn)水分測(cè)定法》)；粗灰分含量測(cè)定方法：取10mg已經(jīng)干燥后的樣品于質(zhì)量恒定的瓷坩堝中，然后于電爐上加熱炭化，炭化完全后于馬弗爐中550℃灼燒至殘?jiān)蕼\灰色具質(zhì)量恒定為止，冷卻后稱(chēng)量，計(jì)算；總糖含量的測(cè)定方法[11]：采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量。

1.3.3 大孔吸附樹(shù)脂純化燕麥ACE抑制肽[12]

1.3.3.1 樹(shù)脂的選擇

表1 3種大孔樹(shù)脂的型號(hào)及物理參數(shù)Table 1 Model and physical parameters of 3 kinds of macroporous resins

分別對(duì)樹(shù)脂的極性、比表面積和平均孔徑進(jìn)行考察，選擇大孔吸附樹(shù)脂DA201-C、Amberlite XAD1600、Amberlite XAD7HP進(jìn)行靜態(tài)吸附試驗(yàn)，比較這3種大孔吸附的純化效果，3種大孔樹(shù)脂的參數(shù)見(jiàn)表1。

1.3.3.2 樹(shù)脂的活化及預(yù)處理

首先使用2BV無(wú)水乙醇浸泡樹(shù)脂24h，使其充分溶脹，然后將樹(shù)脂裝柱，用8～10BV無(wú)水乙醇以3～4BV/h的流速通過(guò)樹(shù)脂層，至流出液在波長(zhǎng)220nm處吸光度小于0.1(以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照)，乙醇處理后，以6～8BV/h流速的去離子水置換出樹(shù)脂中的乙醇，直至流出液無(wú)乙醇味即可投入使用。

1.3.3.3 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)篩選樹(shù)脂

于250mL具塞錐形瓶中加入10g預(yù)先處理過(guò)的樹(shù)脂，再加入50mL 10mg/mL酶解產(chǎn)物溶液，調(diào)pH5，放入25℃恒溫水浴搖床中振蕩(150次/min)。于20、40、60、80、95、110、125、140、160、180、210、240min分別取樣，采用Folin-酚法測(cè)定其多肽含量，分別計(jì)算3種大孔吸附樹(shù)脂的吸附率。

1.3.3.4 動(dòng)態(tài)吸附及解吸實(shí)驗(yàn)

柱條件：色譜柱φ2.5cm×60cm，床體積200mL，樹(shù)脂DA201-C，上樣量200mL，上樣流速1.6mL/min，去離子水沖洗流速2mL/min，乙醇洗脫流速2mL/min，定時(shí)收集5min/管。

操作方法：以一定流速上樣后，先用去離子水洗滌層析柱，將未吸附的酶解物去除，同時(shí)在上樣及水洗過(guò)程中定時(shí)收集層析柱流下的液體(5min/管)，分別測(cè)量每根試管的電導(dǎo)率，糖含量(苯酚-硫酸法)和肽的吸光度(波長(zhǎng)220nm處)，當(dāng)水洗液的電導(dǎo)率與水幾乎一致或不再變化時(shí)，再用一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫，收集洗脫液(5min/管)，再合并收集洗脫峰液，濃縮去除乙醇，冷凍干燥，得到純度較高的燕麥肽，檢測(cè)其成分。

1.3.3.5 利用高效液相色譜儀測(cè)定純化前后燕麥多肽分子質(zhì)量分布

色譜條件：色譜柱TsK gel 2000 SWXL 300mm×7.8mm，流動(dòng)相：乙腈-水-三氟乙酸=30:70:0.1(V/V)，檢測(cè)波長(zhǎng)UV280nm，流速1mL/min，柱溫30℃。樣品制備：以流動(dòng)相為溶劑配制質(zhì)量濃度5mg/mL的樣品溶液，再用微孔膜(0.45μm)過(guò)濾后供進(jìn)樣。標(biāo)準(zhǔn)樣品：將牛血清蛋白(Mw67000)、VB12(Mw1335)、氧化型谷胱甘肽(Mw614)配成混標(biāo)，每種物質(zhì)含量均為5mg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：將3種標(biāo)準(zhǔn)樣品按5mg/mL配制，按照上述色譜條件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 波長(zhǎng)280nm處3種標(biāo)準(zhǔn)樣品的HPLC圖譜Fig.1 HPLC profiles of three standard samples at 280 nm

根據(jù)凝膠滲透層析原理，分子質(zhì)量大的物質(zhì)先被洗脫下來(lái)，從圖1中可以看到洗脫峰出現(xiàn)時(shí)所對(duì)應(yīng)的洗脫時(shí)間分別為5.514、9.638、10.426min，以分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值對(duì)洗脫時(shí)間作圖，采用最小二乘法，求出直線(xiàn)的回歸方程：y=－0.4141x+7.1103(x代表洗脫時(shí)間，y代表分子質(zhì)量對(duì)數(shù))，其回歸系數(shù)R2=0.9999。

表2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分子質(zhì)量與洗脫時(shí)間Table 2 Molecular mass and elution time of standard samples

1.3.4 純化前酶解液的預(yù)處理工藝

將按1.3.1節(jié)方法制備的酶解液冷卻后，按E/S為1%添加β-葡聚糖酶，60℃水浴中反應(yīng)30min，80℃下滅酶5min；待酶解液冷卻后調(diào)pH4.5(糖化酶最適pH值)，再按E/S為1%添加糖化酶，60℃水浴中繼續(xù)反應(yīng)3h，80℃下滅酶10min。之后在12000r/min條件下離心5min，所得上清液(盡量除去離心液表面上的油脂)進(jìn)行抽濾。

1.3.5 凝膠層析純化法[13-14]

1.3.5.1 凝膠層析法

采用葡聚糖凝膠SephadexG-15對(duì)純化后燕麥ACE抑制肽進(jìn)行分級(jí)分離，用蒸餾水作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，洗脫組分分管收集，3mL/管，分峰合并收集，濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，備用。凝膠柱條件：色譜柱φ 1.5cm×60cm，上樣質(zhì)量濃度50mg/mL，上樣量3mL，上樣流速：0.6mL/min，定時(shí)收集：5min/管。樣品的測(cè)定：用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)280nm處逐管測(cè)定吸光度A280nm。

1.3.5.2 ACE抑制肽對(duì)pH值的穩(wěn)定性

配制pH2.0～10.0的系列緩沖液：pH3.5～5.5，采用0.1mol/L醋酸鈉緩沖液；pH6.0～7.5 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液；pH8.0～10.0 0.1mol/L碳酸鹽緩沖液。ACE抑制肽分別與不同pH值緩沖液混合，于4℃條件下處理12h后，再在pH8.3 0.1mol/L硼酸緩沖液(ACE抑制活性檢測(cè)的最適pH值)中處理12h，再檢測(cè)其ACE抑制活性，與原測(cè)值進(jìn)行比較，得到相對(duì)活性，評(píng)估ACE抑制肽對(duì)pH值的穩(wěn)定性。

1.3.5.3 ACE抑制肽對(duì)溫度的穩(wěn)定性

在最適pH值條件下，將ACE抑制肽在不同的溫度下(25～95℃)保溫30min后，迅速冷卻，再檢測(cè)其ACE抑制活性，與原測(cè)值進(jìn)行比較，得到相對(duì)活性，評(píng)估ACE抑制肽在不同溫度下的穩(wěn)定性。

1.3.5.4 ACE抑制肽的體外消化實(shí)驗(yàn)[15-17]

分別稱(chēng)取5mg胃蛋白酶/胰蛋白酶溶于pH2.0 0.1mol/L KCl-HCl緩沖液/pH8.0 0.1mol/L磷酸緩沖液)中，定容至100mL，配制成0.05mg/mL胃蛋白酶/胰蛋白酶溶液。稱(chēng)取50mg(多肽含量)分離峰凍干粉溶于5mL 0.05mg/mL的胃蛋白酶/胰蛋白酶溶液中(E/S=1:200)，于37℃水浴振蕩反應(yīng)3～4h。隨后于100℃水浴中加熱5min滅酶終止反應(yīng)。調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH8.3(胰蛋白酶不調(diào)pH值)，以12000r/min離心10min，上清液用于測(cè)定ACE抑制活性。

另取2mL經(jīng)胃蛋白酶消化處理后的溶液，加入2mL 0.05mg/mL的胰蛋白酶溶液在37℃水浴振蕩反應(yīng)4h(E/S=1:200)。隨后于100℃水浴中加熱5min滅酶終止反應(yīng)，以12000r/min離心10min，上清液用于測(cè)定ACE抑制活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹(shù)脂的篩選

2.1.1 大孔吸附樹(shù)脂DA201-C、XAD1600和XAD7HP靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

大孔吸附樹(shù)脂DA201-C、XAD1600和XAD7HP在靜態(tài)吸附過(guò)程中對(duì)燕麥酶解產(chǎn)物的吸附率隨時(shí)間的變化規(guī)律見(jiàn)圖2。

由圖2可知，在靜態(tài)吸附過(guò)程中，3種大孔吸附樹(shù)脂在最初的60min左右吸附率的增加均十分迅速，其中大孔吸附樹(shù)脂DA201-C在60min時(shí)吸附率達(dá)到64.6%，此后的增加趨于平緩，到95min時(shí)達(dá)到吸附飽和，吸附率為66.5%，此后吸附處于動(dòng)態(tài)平衡，吸附率不再增加；大孔吸附樹(shù)脂XAD1600在60min時(shí)吸附率達(dá)到39.8%，此后的增加趨于平緩，到140min時(shí)達(dá)到吸附飽和，吸附率為47.8%，此后吸附處于動(dòng)態(tài)平衡，吸附率不再增加；大孔吸附樹(shù)脂XAD7HP在40min時(shí)吸附率達(dá)到34.3%，此后的增加趨于平緩，到125min時(shí)達(dá)到吸附飽和，吸附率為35.7%，此后吸附處于動(dòng)態(tài)平衡，吸附率不再增加。

圖2 pH5時(shí)大孔吸附樹(shù)脂DA201-C、XAD1600和XAD7HP靜態(tài)吸附率隨時(shí)間的變化Fig.2 Static absorption rate of macroporous resins DA201-C, XAD1600 and XAD7HP at pH 5 as the extension of time

對(duì)3種大孔吸附樹(shù)脂的靜態(tài)吸附性能進(jìn)行比較，其最大吸附率及達(dá)到最大值的時(shí)間見(jiàn)表3。

表3 3種樹(shù)脂靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)最大吸附率Table 3 Maximum adsorption rates of three kinds of resins

由表3可知大孔吸附樹(shù)脂DA201-C的最大吸附率最大，達(dá)到66.5%，依次是XAD1600 47.8%，最后是XAD7HP 35.7%，可見(jiàn)DA201-C吸附率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于XAD1600和XAD7HP。另外比較達(dá)到最大吸附率的時(shí)間可知，DA201-C在95min即達(dá)到最大值，吸附效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于另外兩種樹(shù)脂，因此大孔吸附樹(shù)脂DA201-C更適合燕麥ACE抑制肽的純化。

2.1.2 酶解液的pH值對(duì)動(dòng)態(tài)吸附率的影響

酶解產(chǎn)物中的肽在溶液中的伸展方式會(huì)隨pH值的變化而不同，肽與大孔吸附樹(shù)脂間是通過(guò)氫鍵或范德華力相互作用結(jié)合的，這也會(huì)受pH值影響，因此，上樣時(shí)酶解液的pH值會(huì)對(duì)動(dòng)態(tài)吸附率產(chǎn)生較大影響，從圖3可以明顯看出這一點(diǎn)。

從圖3可以看出，在酶解液pH5時(shí)上樣，樹(shù)脂的吸附率最高，因此宜將酶解液調(diào)至pH5，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)。

圖3 酶解液的pH值對(duì)動(dòng)態(tài)吸附率的影響Fig.3 Effect of hydrolysate pH on dynamic adsorption rate of macroporous resin

2.2 未進(jìn)行預(yù)處理酶解液動(dòng)態(tài)吸附及解吸實(shí)驗(yàn)

2.2.1 純化前后酶解產(chǎn)物的成分及ACE抑制率的比較將純化前后的酶解產(chǎn)物的凍干粉分別配制為多肽含量5mg/mL的水溶液，測(cè)定其蛋白質(zhì)含量、多糖含量及無(wú)機(jī)鹽等其他成分，并比較純化前后酶解產(chǎn)物的ACE抑制率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 純化前后成分及ACE抑制率的比較Table 4 Comparison on compositions of ACE inhibitory peptide before and after purification %

從表4可以看出，通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂DA201-C的純化可起到脫糖脫鹽的效果，純化前酶解產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量?jī)H為28.38%，但多糖含量高達(dá)66.76%；而純化后多肽含量提高了一倍多，而糖含量下降了50%，說(shuō)明DA201-C有較好的脫糖效果。另外看到純化前后無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)的含量有大幅下降，證明DA201-C也有較好的脫鹽效果。雖然DA201-C有較好的純化效果，但是還要看到，純化后多糖成分仍占到產(chǎn)物含量的近40%，含有較多多糖成分的ACE抑制肽會(huì)為后續(xù)分離帶來(lái)很大不便，因此應(yīng)對(duì)純化前燕麥肽酶解產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)處理，去除其中一部分多糖成分。

另外，純化前后燕麥多肽的ACE抑制率有了較大提高，由于這主要和大孔吸附樹(shù)脂DA201-C的純化密切相關(guān)，純化過(guò)程去掉了燕麥多肽中雜質(zhì)的干擾，同時(shí)也證明純度較高的燕麥多肽具有較好ACE抑制活性，為后續(xù)分離提供依據(jù)。

2.2.2 HPLC測(cè)定純化后燕麥肽的分子質(zhì)量分布

分子質(zhì)量大小是檢驗(yàn)ACE抑制肽的一個(gè)指標(biāo)，應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定純化后產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布狀態(tài)，結(jié)果如圖4所示。

圖4 純化后燕麥多肽的分子質(zhì)量分布Fig.4 Molecular weight distribution of purified peptides from oat

從圖4可以看出，純化產(chǎn)物中主要包括3個(gè)組分峰，洗脫時(shí)間分別出現(xiàn)在9.373、10.114、11.463min，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程得出各峰的對(duì)應(yīng)分子質(zhì)量為1693.95、835.80、230.94D，根據(jù)峰面積計(jì)算可知這3種物質(zhì)分別占到純化產(chǎn)物中的30.82%、55.96%、13.20%，三者共占純化產(chǎn)物的99.7%。但是ACE抑制肽一般分子質(zhì)量為200～1500D，說(shuō)明純化產(chǎn)物的分子質(zhì)量值偏大，不適合ACE抑制肽的后續(xù)分離。但是純化產(chǎn)物的分子質(zhì)量全部小于2000D，表明大孔吸附樹(shù)脂DA201-C對(duì)小分子肽的吸附作用很好。

2.3 對(duì)純化前酶解液進(jìn)行預(yù)處理后動(dòng)態(tài)吸附及解吸實(shí)驗(yàn)

2.3.1 對(duì)純化前酶解液進(jìn)行預(yù)處理

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)可以初步證明燕麥中的多糖成分與蛋白成分可能是結(jié)合在一起的，形成了類(lèi)似糖蛋白的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致純化后產(chǎn)物中仍有一定的多糖，故考慮可以對(duì)純化前酶解液進(jìn)行預(yù)處理，將結(jié)合的多糖成分酶解，酶解液中游離的多糖成分不會(huì)被大孔吸附樹(shù)脂吸附，可能會(huì)進(jìn)一步改善純化效果，因此在蛋白酶處理后利用β-葡聚糖酶和糖化酶酶解燕麥酶解液中的多糖成分。

2.3.2 純化前后酶解產(chǎn)物的成分及ACE抑制率的比較

將純化前后的酶解產(chǎn)物的凍干粉分別配制為多肽含量5mg/mL的水溶液，測(cè)定其蛋白質(zhì)含量、多糖含量及無(wú)機(jī)鹽等其他成分，并比較純化前后酶解產(chǎn)物的ACE 抑制率，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 純化前后成分及ACE抑制率的比較Table 5 Comparison of ACE inhibitory rates of peptide before and after purification %

從表5可以看出，經(jīng)過(guò)對(duì)燕麥酶解液的糖化酶處理，使純化效果得到很大改善，其燕麥多肽蛋白含量高達(dá)80.36%，多糖成分下降至18.68%，無(wú)機(jī)鹽等成分下降至0.96%。與表4結(jié)果相比，其酶解原液的蛋白質(zhì)含量有的提高，多糖含量有所降低，這是由于酶解原液中加入β-葡聚糖酶和糖化酶，而酶屬于蛋白質(zhì)；另外經(jīng)過(guò)β-葡聚糖酶和糖化酶的酶解，酶解原液糖含量下降。實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)過(guò)β-葡聚糖酶和糖化酶的處理，純化效果有顯著提高，并進(jìn)一步證明燕麥中蛋白質(zhì)和多糖可能是以一種結(jié)合物形式存在的。

另外，純化后燕麥多肽的ACE抑制率比燕麥肽水解原液提高很多，這說(shuō)明了去除多糖等雜質(zhì)后，ACE抑制肽的濃度大大提高，故其ACE抑制功效體現(xiàn)更加明顯，表明純化后的燕麥多肽是較好的ACE抑制肽源。

2.3.3 酶解原液的動(dòng)態(tài)吸附及水洗過(guò)程

酶解原液上樣后先用去離子水洗滌層析柱，同時(shí)在上樣及水洗過(guò)程中定時(shí)收集層析柱流下的液體(5min/管)，分別測(cè)量每根試管的電導(dǎo)率，糖含量和肽的吸光度(波長(zhǎng)220nm處)，整個(gè)上樣過(guò)程變化如圖5所示。

圖5 酶解產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)吸附脫鹽和脫糖曲線(xiàn)Fig.5 Dynamic adsorption curves of hydrolysates for desalination and the removal of sugar

從圖5可以看出，當(dāng)洗脫體積在0～100mL時(shí)，多肽吸光度非常低，說(shuō)明此時(shí)為樹(shù)脂吸附多肽階段。此后，吸光度開(kāi)始迅速上升，說(shuō)明樹(shù)脂吸附量已經(jīng)飽和。而電導(dǎo)率值(反映鹽含量)和糖含量在洗脫體積約為300mL處達(dá)到最大值。而未被吸附的肽的吸光度的出峰位置則較靠后且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，在洗脫體積超過(guò)1000mL(5～6BV)后它們的變化都趨于平緩。

2.3.4 樹(shù)脂解吸過(guò)程

應(yīng)用75%和25%乙醇對(duì)燕麥多肽進(jìn)行解吸，解吸方法見(jiàn)1.3.3.4節(jié)。洗脫過(guò)程中5min/管收集解吸液，隨后測(cè)量解吸液在220nm條件下的吸光度，確定解吸液中多肽的出現(xiàn)時(shí)間，洗脫圖譜見(jiàn)圖6、7。

圖6 75%乙醇洗脫圖Fig.6 Elution profile of ACE inhibitory peptide by 75% ethanol elution

圖7 25%乙醇洗脫圖Fig.7 Elution profile of ACE inhibitory peptide by 25% ethanol elution

從圖6、7可以看出，75%乙醇解吸時(shí)曲線(xiàn)無(wú)規(guī)律性，但洗脫劑消耗較??；而25%乙醇洗脫的數(shù)據(jù)有規(guī)律性，峰值出現(xiàn)明顯，但洗脫劑消耗偏大，影響生產(chǎn)效率。計(jì)算解吸率可知，75%乙醇解吸率為75.46%，25%乙醇解吸率為70.52%，75%乙醇解吸率較高，可以減少酶解液損失，因此選擇75%乙醇進(jìn)行解吸。

2.3.5 純化前后酶解產(chǎn)物氨基酸成分分析

將純化前后的酶解產(chǎn)物的凍干粉進(jìn)行氨基酸成分分析，比較純化前后各種氨基酸的含量變化，分析其對(duì)ACE抑制率變化的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證純化效果，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 純化前后酶解產(chǎn)物的氨基酸成分比較Table 6 Amino acid compositions of hydrolysates before and after purification

從表6可以看出，純化后燕麥ACE抑制肽的疏水性氨基酸、芳香族氨基酸和支鏈氨基酸殘基含量均高于純化前酶解產(chǎn)物，最重要的是脯氨酸的含量純化后大幅上升，該氨基酸對(duì)ACE抑制活性的貢獻(xiàn)很大，故從氨基酸含量的變化上證明了純化后的酶解物有利于ACE抑制活性的提高。此外，純化后ACE抑制肽的必需氨基酸含量高于純化前產(chǎn)物，表明純化過(guò)程使燕麥的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到了很大的提高。

2.3.6 HPLC測(cè)定純化后燕麥ACE抑制肽的分子質(zhì)量分布

應(yīng)用高效液相色譜儀對(duì)1.3.4節(jié)方法制備的燕麥酶解液的純化產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布狀態(tài)應(yīng)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 純化后燕麥ACE抑制肽的的分子質(zhì)量分布Fig.8 Molecular mass distribution of purified ACE inhibitory peptides

如圖8所示，純化產(chǎn)物中主要包括4個(gè)組分峰，洗脫時(shí)間分別出現(xiàn)在9.657、10.411、10.748、11.422min，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算出各峰的對(duì)應(yīng)分子質(zhì)量為1292.11、629.65、456.67、240.10D，根據(jù)峰面積計(jì)算可知這4種物質(zhì)分別占到純化產(chǎn)物中的25.08%、35.38%、13.39%、25.96%，四者共占純化產(chǎn)物的99.82%。綜上所述，純化后燕麥ACE抑制肽的分子質(zhì)量分布在240.10～1292.11D之間，這部分物質(zhì)在整個(gè)純化產(chǎn)物中占99.82%，其中分子質(zhì)量629.65D的組分在純化產(chǎn)物中含量最高達(dá)到35.38%，以上結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)對(duì)多糖的酶解后，再利用大孔吸附樹(shù)脂DA201-C純化燕麥酶解產(chǎn)物，其純化效果較好，分子質(zhì)量范圍在200～1500D之間，為后續(xù)分離純化提供了較好的多肽源。

2.4 凝膠層析的研究

2.4.1 Sephadex G-15分離燕麥ACE抑制肽所得不同組分的ACE抑制活性

根據(jù)1.3.5.1節(jié)凝膠層析法混合肽被分成5個(gè)組分，各組分冷凍干燥后，稱(chēng)取一定量各組分峰凍干粉用蒸餾水配成多肽含量為0.5mg/mL溶液用于ACE抑制活性的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 不同SephadexG-15分離組分的ACE抑制活性Fig.9 ACE inhibitory activities of different factions using SephadexG-15 separation

從圖9可以看到，純化后燕麥多肽產(chǎn)物經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠SephadexG-15分離所得各組分A、B、C、D、E均具有ACE抑制活性，其ACE抑制活性分別為50.15%、56.98%、70.31%、86.42%、78.58%，其中D組分的ACE抑制活性最高，而A和B的ACE抑制活性較低，故制備收集D組分峰產(chǎn)物，其IC50為0.103mg/mL，其分子質(zhì)量約為545D，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)材料。

2.4.2 D組分ACE抑制肽對(duì)pH值的穩(wěn)定性

按照1.3.5.2節(jié)方法，檢測(cè)D組分峰對(duì)pH值的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖1 0。

圖10 ACE抑制肽(D組分峰)在不同pH值中的穩(wěn)定性Fig.10 Stability of ACE inhibitory peptide (fraction D) at different pH levels

從圖10可以看出，ACE抑制活性受pH值影響并不大，D組分ACE抑制肽對(duì)pH值具有較好的穩(wěn)定性，酸性條件下ACE抑制活性損失大于堿性條件，而中性pH值下ACE抑制活性最高。

2.4.3 D組分ACE抑制肽對(duì)溫度的穩(wěn)定性

按照1.3.5.3節(jié)方法，檢測(cè)D組分峰的溫度穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖11。

圖11 ACE抑制肽(D組分峰)在不同溫度下的穩(wěn)定性Fig.11 Stability of ACE inhibitory peptide (fraction D) at different temperatures

從圖11可以看出，經(jīng)各種溫度處理后，D組分峰的ACE抑制活性幾乎沒(méi)有損失，均保留了大于90%的ACE抑制活性，這說(shuō)明D組分峰的ACE抑制活性在不同溫度中具有優(yōu)越的穩(wěn)定性。

2.4.4 D組分ACE抑制肽的體外消化實(shí)驗(yàn)

按照1.3.5.4節(jié)和1.3.5.5節(jié)方法測(cè)定消化酶處理前和處理后水解物IC50值的變化以評(píng)價(jià)水解物的消化穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 消化酶處理對(duì)ACE抑制肽(D組分峰)的ACE抑制活性的影響Table 7 Effect of treatment with digestive enzyme on activity of ACE inhibitory peptide (fraction D)

從表7可以看出，D組分峰經(jīng)過(guò)胃腸道消化酶處理后仍然具有很高的活性，說(shuō)明其對(duì)消化酶的水解具有一定的抗性，并且經(jīng)過(guò)消化酶水解后還能夠釋放出新的ACE抑制肽。由于胃蛋白酶加胰蛋白酶的處理方式與食物在體內(nèi)消化過(guò)程類(lèi)似，進(jìn)而說(shuō)明了燕麥來(lái)源的ACE抑制肽具有在胃腸道中吸收，然后進(jìn)入血液循環(huán)的可能性，口服這種活性肽有可能在人體發(fā)揮較好的降血壓作用。

3 結(jié) 論

應(yīng)用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)燕麥ACE抑制肽進(jìn)行分離純化，并對(duì)純化產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布狀態(tài)及其活性進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)大孔吸附樹(shù)脂DA201-C對(duì)燕麥ACE抑制肽的純化效果較好，純化前使用β-葡聚糖酶和糖化酶對(duì)酶解液進(jìn)行預(yù)處理，可以提高純化效果，純化后產(chǎn)物的ACE抑制率高于純化前產(chǎn)物，并且純化后燕麥ACE抑制肽的疏水性氨基酸、芳香族氨基酸和支鏈氨基酸殘基含量均高于純化前酶解產(chǎn)物，純化后ACE抑制肽的分子質(zhì)量分布在240.10～1292.11D之間，全部小于1500D，可見(jiàn)其是較好的后續(xù)分離多肽源。通過(guò)利用葡聚糖凝膠SephadexG-15對(duì)純化后燕麥多肽進(jìn)行分離得到D組分，其IC50為0.103mg/mL，分子質(zhì)量為545D，具有較強(qiáng)的ACE抑制活性、pH值穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性，且在體外對(duì)消化酶體現(xiàn)出一定的抗性，具有口服降壓的可能，因此本實(shí)驗(yàn)為燕麥ACE抑制肽作為降壓有效成分的研究提供了參考和依據(jù)。

[1] 黃艾祥, 肖蓉. 燕麥及其營(yíng)養(yǎng)食品的研究開(kāi)發(fā)[J]. 糧食與飼料工業(yè),2000(9): 49-50.

[2] 吳建平, 丁霄霖. 食品蛋白質(zhì)降血壓肽的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 1998, 13(5): 10-14.

[3] 趙海珍, 陸兆新, 劉戰(zhàn)民. 天然食品來(lái)源的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生化藥物雜志, 2004, 25(5): 315-317.

[4] BYUN H G, KIM S K. Structure and activity of angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides derived from Alaskan pollack skin[J]. Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2002, 35(2): 239-243.

[5] NAKAMURA Y, MASUDA O, TAKANO T. Decrease of tissue angiotensin I -converting enzyme activity upon feeding sour milk in spontaneous hypertensive rates[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry,1996, 60(3): 488-489.

[6] MORIGIWA A, KITABATAKE A, FUJIMOTO Y, et al. Angiotensin converting enzyme-inhibitory triterpenes from G lucidum[J]. Chemical Pharmaceutical Bulletin, 1986, 34(7): 3025-3028.

[7] 韓揚(yáng), 何聰芬, 董銀卯, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助酶法制備燕麥ACE抑制肽的工藝研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(22): 44-49.

[8] 余冰賓. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京: 清華大學(xué)出版社, 2004: 54-62; 133-136.

[9] CUSHMAN D W, CHEUNG H S. Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung[J]. Biochemical Pharmacology, 1971, 20: 1673-1648.

[10] WU J P, DING X L. Characterization of inhibition and stability of soyprotein-derived angiotensin Ⅰ-converting enzyme inhibitory peptides[J]. Food Research International, 2002, 35: 367-375.

[11] 李寶良, 李書(shū)劍. 香菇多糖苯酚試劑測(cè)定研究[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2005, 15(11): 1329-1330.

[12] 何炳林, 黃強(qiáng). 離子交換與吸附樹(shù)脂[M]. 上海: 上?？萍冀逃霭嫔? 1995.

[13] 金哲洙, 蔡英姬, 金京玲. 抗真菌蛋白質(zhì)的分離純化[J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2000, 13(l): 30-32.

[14] 王豐, 梅子青, 周秋麗, 等. 鹿茸多肽的分離純化及藥理活性[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào): 理學(xué)版, 2003, 41(l): 111-114.

[15] LECLERC P L, GAUTHIER S F, BACHELARD H, et al. Antihypertensive activity of casein-enriched milk fermented by Lactobacillus helveticus[J]. RTICLE International Dairy Journal, 2002, 12(12): 995-1004.

[16] VERMEIRSSEN V, CAMP J V, VERTRAETE W. Optimisation and validation of an angiotensin-converting enzyme inhibition assay for the screening of bioactive peptides[J]. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2002, 51: 75-87.

[17] PARROT S, DEGRAEVE P, CURIA C, et al. In vitro study on digestion of peptides in Emmental cheese: analytical evaluation and influence on angiotensinⅠconverting enzyme inhibitory peptides[J].Nahrung/Food, 2003, 47(2): 87-94.

Separation, Purification and Activity of ACE Inhibitory Peptides from Oat

WANG Shuang1,2，WANG Chang-tao1,*，HAN Yang1
(1. Beijing Technology and Business University, Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development, Beijing 100048, China；2. College of Pharmaceutical, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

Through comparing three kinds of macroporous resins, DA201-C resin was selected to purify ACE inhibitory peptides from oat. The ACE inhibition rate of purified peptide from oat was 92.86%. The molecular mass of HPLC-purified oat ACE inhibitory peptides was the range of 240.10－1292.11 D. SephadexG-15 gel was used to purify ACE inhibitory peptides to obtain a fraction D with IC50 of 0.103 mg/mL and molecular weight of 545 D. Results indicated that macroporous resin and gel filtration chromatography could better purify ACE inhibitory peptides from oat.

oat； ACE inhibitory peptide；macroporous resin； gel filtration chromatography

TS201.1

A

1002-6630(2010)24-0222-08

2010-08-26

北京市科技新星項(xiàng)目(2008B08)

王雙(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯帉W(xué)。E-mail：wangs1985@126.com

王昌濤(1975—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)樯锘?。E-mail：wangct@th.btbu.edu