陳易彬,馬小燕

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,陜西西安 710021)

中國(guó)大鯢可溶性蛋白制備及SDS-PAGE電泳分析

陳易彬,馬小燕＊

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,陜西西安 710021)

采用超聲法制備大鯢可溶性蛋白質(zhì);從提取溫度、時(shí)間、液料比方面確定適宜的工藝參數(shù),并對(duì)所得可溶性蛋白的分子量進(jìn)行研究。均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在提取溫度為 45℃、提取時(shí)間為 30min、液料比為 10∶1時(shí),大鯢可溶性蛋白溶出量最多,達(dá) 63.57mg/g。SDS-PAGE電泳分析可溶性蛋白的組成表明,大鯢可溶性蛋白亞基分布廣泛,分子量低,易于消化吸收,為優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)蛋白。

大鯢可溶性蛋白,SDS-PAGE電泳

中國(guó)大鯢 (Andrias davidianus),俗稱“娃娃魚(yú)”[1],肉質(zhì)鮮美,含有優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)和豐富的氨基酸、微量元素,經(jīng)常食用可以聰明益智、延緩衰老、提高造血和免疫功能,對(duì)防止心腦血管系統(tǒng)、惡性貧血和惡性腫瘤有很好的作用[2]。近年來(lái),隨著人工馴養(yǎng)和繁殖技術(shù)的發(fā)展,大鯢產(chǎn)量大增,其食用和藥用價(jià)值也引起人們?cè)絹?lái)越多的重視。本工作采用超聲法制備大鯢可溶性蛋白,考察提取溫度、時(shí)間及液料比對(duì)制備效果的影響,確定其適宜的工藝參數(shù),并對(duì)可溶性蛋白的分子量進(jìn)行研究,為大鯢資源的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

大鯢 實(shí)驗(yàn)室提供;牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;考馬斯亮藍(lán) G-250 天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心;低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白 香港昊柏技術(shù)有限公司;其它試劑 均為分析純。

K Q-200K DE型可調(diào)數(shù)控超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司;UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司;DDY-10Cz型電泳儀、DYCZ-22A垂直板電泳槽 北京六一儀器廠;Bandscan 5.0軟件。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超聲法制備大鯢魚(yú)肉中的可溶性蛋白

1.2.1.1 工藝流程 低溫取樣→加提取液研磨→超聲提取→離心→收集上清液→低溫儲(chǔ)藏[3]

1.2.1.2 單因素考察 分別以不同提取溫度、時(shí)間及液料比做單因素實(shí)驗(yàn),考察單因素對(duì)可溶性蛋白含量的影響。

1.2.1.3 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,確定均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素與水平[4]。以可溶性蛋白含量為指標(biāo),對(duì)大鯢可溶性蛋白的制備工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.2 大鯢可溶性蛋白的 SDS-PAGE電泳 采用15%分離膠、5%濃縮膠對(duì)可溶性蛋白進(jìn)行 SDSPAGE電泳分析[5]。拍照并用 Bandscan5.0軟件分析。

1.2.3 可溶性蛋白含量測(cè)定 采用 Bradford法測(cè)定可溶性蛋白含量[6]。

1.2.4 蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定 在 Laemmli[7]方法中,蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù) (lg)與其相對(duì)遷移率呈良好的線性關(guān)系,因此,以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分子量對(duì)遷移率作圖,得標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)未知蛋白的遷移率,從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出其分子量。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制最終濃度為 0、20、40、60、70、80、100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液,各取標(biāo)準(zhǔn)液 1mL,加入考馬斯亮藍(lán) 5mL,混合反應(yīng) 2min后,在 595nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度,以蛋白質(zhì)含量(μg)為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo),得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y=0.005x+0.011, R2=0.998,線性范圍為 10～100μg/mL。

2.2 單因素對(duì)超聲法制備大鯢可溶性蛋白的影響

2.2.1 提取溫度的影響 在時(shí)間為 30min,液料比為10∶1的條件下,不同提取溫度對(duì)可溶性蛋白溶出量的影響如圖 1所示。

圖 1 提取溫度對(duì)提取效果的影響

由圖 1可以看出,當(dāng)溫度低于 30℃時(shí),蛋白質(zhì)溶出量增加趨勢(shì)平坦;從 30℃開(kāi)始蛋白質(zhì)溶出量增加趨勢(shì)變得顯著;超過(guò) 45℃后,蛋白質(zhì)溶出量開(kāi)始下降。因此,45℃是提取可溶性蛋白質(zhì)的適宜溫度。

2.2.2 提取時(shí)間的影響 在溫度為 45℃,液料比為10∶1條件下,不同作用時(shí)間對(duì)可溶性蛋白溶出量的影響如圖 2所示。

圖 2 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

從圖 2可以看出,提取時(shí)間為 30min時(shí),可溶性蛋白溶出量最多;提取時(shí)間低于 30min時(shí),隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),可溶性蛋白溶出量增多,當(dāng)?shù)竭_(dá) 30min后,可溶性蛋白溶出量反而降低。因此,提取時(shí)間為30min為宜。

2.2.3 液料比的影響 在提取時(shí)間為 30min,提取溫度為 45℃條件下,不同液料比對(duì)可溶性蛋白溶出量的影響如圖 3所示。

從圖 3可以看出,可溶性蛋白溶出量隨液料比增加而迅速增加,在液料比 10∶1以上時(shí),可溶性蛋白溶出量增加緩慢。因此,液料比選擇 10∶1較為合適。

2.3 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

圖 3 液料比對(duì)提取效果的影響

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分別以提取溫度、提取時(shí)間、液料比為影響因素,以可溶性蛋白溶出量為指標(biāo),選擇3因素5水平的均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表 1 均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將表 1得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行逐步回歸分析[8],得到回歸方程為:Y=45.7+0.441X1+0.264X2-0.931X3,復(fù)相關(guān)系數(shù) r=0.9973。由以上方程可以看出:液料比對(duì)制備效果影響最大,且液料比越大,制備效果越差。其次為超聲溫度;超聲時(shí)間對(duì)制備效果影響最小。由此得出最佳超聲制備方案為:溫度 45℃,時(shí)間30min,液料比為 10∶1。

2.4 大鯢可溶性蛋白質(zhì)的 SDS-PAGE電泳

采用 15%分離膠、5%濃縮膠對(duì)大鯢可溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行 SDS-PAGE分析,用相機(jī)拍照并用Bandscan5.0軟件分析所得到的電泳圖譜如圖 4所示。

圖 4 大鯢可溶性蛋白的 SDS-PAGE電泳圖譜

對(duì)大鯢可溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行 S DS-PAGE電泳分析圖譜顯示,大鯢可溶性蛋白質(zhì)亞基分子量位于 121～5kDa范圍內(nèi),共有 14條帶,分子量分別為 121、93、78、67、41、35、29、19、18、14、12、9、6、5kDa,皆為低分子量的蛋白。其中分子量為 41kDa的蛋白含量最多,分子量為 35kDa和 93kDa的蛋白含量也較多。

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)對(duì)影響大鯢蛋白溶出量的超聲提取時(shí)間、提取溫度和液料比進(jìn)行了均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:液料比對(duì)蛋白溶出量的影響最大,其次為溫度和時(shí)間。最佳制備工藝條件為:提取溫度 45℃,時(shí)間30min,液料比為 10∶1。

3.2 SDS-PAGE電泳圖譜顯示,大鯢可溶性蛋白組分種類較多,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,其分子量較小,有利于人體對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收,是一種優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)蛋白。

[1]中國(guó)野生動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì),費(fèi)梁 .中國(guó)兩棲動(dòng)物圖鑒[M].鄭州:河南科學(xué)技術(shù)出版社,1999:38-40.

[2]高士賢,戴定遠(yuǎn),范勤德 .常見(jiàn)藥用動(dòng)物[M].上海:上?？萍汲霭嫔?1984:14.

[3]喬志剛,等 .中國(guó)大鯢消化系統(tǒng) 13種器官的蛋白水解酶種類和活性分析[J].動(dòng)物學(xué)報(bào),2003,49(4):537-539.

[4]方開(kāi)泰 .均勻設(shè)計(jì)與均勻設(shè)計(jì)表[M].北京:科學(xué)出版社, 1994:25-78.

[5]郭堯君 .蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù) [M].北京:科學(xué)出版社, 1999:112-158.

[6]余冰賓 .生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:清華大學(xué)出版社, 2004:136-138.

[7]Laemmli K.Cleavage ofstructural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature,1970,227 (259):680-685.

Preparation and SDS-PAGE analysis of soluble protein of Andrias davidianus

CHEN Y i-b in,MA Xiao-yan＊
(College ofLife Science and Engineering,ShaanxiUniversity of Science and Technology,Xi’an 710021,China)

U ltrasonic m e thod was used to extrac t the solub le p rote ins of And rias david ianus,and w ith a s imp le fac tor exp e r im ent and a uniform des ign,the p rep a ra tion p rocedures we re inves tiga ted.The results showed tha t the op t im a l extrac tion temp e ra ture,t im e,and the ra tio ofwa te r to m a te ria lwe re45℃,30m in and10∶1,resp ec tive ly,and the content of solub le p rote ins in And rias dab id ianus could reach63.57m g/g.SDS-PAGE ana lys is showed tha t the subunitm olecula rwe ight of solub le p rote ins was in a w ide range,which we re a lso low and easy to be absorbed.

And rias david ianus solub le p rote in;SDS-PAGE

TS254.1

A

1002-0306(2010)04-0296-03

2009-05-12 ＊通訊聯(lián)系人

陳易彬 (1955-),男,本科,副教授,研究方向:天然產(chǎn)物的分離與修飾。