王巖巖,劉 濤,張崇堯,尹琳琳,吳光旭

(長江大學(xué)生命科學(xué)院,湖北荊州 434100)

纖維素酶提取蘋果渣黃酮及抗氧化研究

王巖巖,劉 濤,張崇堯,尹琳琳,吳光旭＊

(長江大學(xué)生命科學(xué)院,湖北荊州 434100)

研究了纖維素酶提取蘋果渣黃酮的工藝條件及抗氧化活性。結(jié)果表明,與傳統(tǒng)化學(xué)法相比,纖維素酶法提取蘋果渣黃酮較好,黃酮提取率從 0.43%提高到 0.56%。對(duì)酶法提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到最佳工藝條件為：纖維素酶濃度 0.2%,pH=5.2,酶解溫度 60℃,酶解時(shí)間 40min。在最佳條件下,纖維素酶法所得黃酮的提取率可達(dá)到 1.26%,為化學(xué)法黃酮提取率的 2.93倍。并對(duì)提取的黃酮進(jìn)行羥自由基清除實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)酶法與化學(xué)法提取黃酮的成分清除能力相似,表明兩種方法提取黃酮物質(zhì)結(jié)構(gòu)可能一樣。

纖維素酶,黃酮,蘋果渣

蘋果 荊州市水果市場,榨汁后,60℃通風(fēng)干燥3d,粉碎過40目篩備用;纖維素酶 酶活性≥10U/mg,上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所,分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘋果渣黃酮的提取

1.2.1.1 醇提法[3]將烘干過的蘋果渣粉碎,過 40目篩,稱取 3.00g,加入 90%乙醇水溶液 100mL浸提3h,收集浸提液,濾渣重復(fù)浸提一次,合并兩次的浸提液,過濾,蒸餾濃縮,用蒸發(fā)皿揮干得粗黃酮類物質(zhì)呈棕紅色膏狀(W1)。

1.2.1.2 纖維素酶法[4]稱取蘋果渣粉 3.00g,放入250mL燒杯中,加入0.050g纖維素酶,加入 50mL(pH =4.8)的 HAc-NaAc緩沖液,50℃水浴 1.5h。90℃水浴 30min使酶滅活。加入無水乙醇使其濃度為90%,浸提 3h,回收浸提液,濾渣再加入 90%乙醇溶液 100mL重復(fù)浸提一次,合并兩次的浸提液,過濾,蒸餾濃縮,用蒸發(fā)皿揮干得粗黃酮類物質(zhì)呈棕紅色膏狀

1.2.2 黃酮含量的測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[1]準(zhǔn)確稱取 0.0250蘆丁,用 30%乙醇溶解,完全移入 250mL容量瓶中,定容。取此蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL放入 6支25mL容量瓶中,用 30%乙醇補(bǔ)至 5mL,加入 0.3mL 5%NaNO2溶液搖勻放置 6min;加入 0.3mL 10% Al(NO3)3溶液搖勻,放置 6min;加入 4mL,1mol/L NaOH溶液,搖勻,放置 10min,于波長 510nm處測定吸光度。得回歸方程：y=1.0713x+0.0037,R2= 0.9998。其中：x表示蘆丁濃度 (10-4g/L),y表示對(duì)應(yīng)吸光值(OD)。

1.2.2.2 提取物中黃酮含量的測定 準(zhǔn)確稱取適量的蘋果渣粗黃酮 (W2),用 30%乙醇溶解,定容至100mL;取 5mL放入 3支 25mL容量瓶中,用 30%乙醇補(bǔ)至10mL,加入0.3mL的5%NaNO2溶液搖勻,放置 5min,加 0.7mL 10%的 Al(NO3)3溶液搖勻,放置6min;再加入 4mL 1mol/L NaOH溶液,搖勻,定容,放置 10min后,在波長 510nm測定,將測定的吸光值A(chǔ)帶入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線中,計(jì)算得總黃酮量和黃酮提取率。計(jì)算公式如下：

總黃酮量 (g)=W1×(A-0.0037)×0.0001× 100/W2×1.0713

總黃酮提取率(%)=(總黃酮量/W1)×100%

粗黃酮物質(zhì)提取率(%)=(粗黃酮重量/樣品重量)×100%

其中：W1為不同方法提取得到的蘋果渣粗黃酮重量(g);W2為稱取的適量蘋果渣粗黃酮重量 (g); A表示測定的吸光度。

1.2.3 正交設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn),選取對(duì)提取工藝有影響的主要因素：酶濃度 (E)、酶解溫度 (T)、pH、酶解時(shí)間 (t),按照四因素三水平進(jìn)行 L9(34)實(shí)驗(yàn),各因素水平見表 1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.4 清除羥基自由基活性[5]取 10mL具塞試管,按順序加入 5mmol/L鄰二氮菲 1.5mL、0.5mol/L磷酸緩沖液 pH7.4 3mL、7.5mmol/L FeSO41mL、粗黃酮樣液 3mL、0.1%H2O21mL,用二次蒸餾水稀釋到 10mL,然后于 37℃恒溫水浴鍋保溫 60min,測 A510。未損傷管即：不加 H2O2及抗氧化藥物,標(biāo)記為 A510(未損傷)。損傷管即：只加 H2O2不加抗氧化藥物,標(biāo)記為A510(損傷)。按下式計(jì)算表觀羥自由基清除率 (E)：

E=[A510(加藥)-A510(損傷)]/[A510(未損傷)-A510(損傷)]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶法提取蘋果渣黃酮工藝條件研究

在纖維素酶法提取蘋果渣黃酮的過程中,研究了 pH、酶濃度(E)、酶解時(shí)間(t)、酶解溫度對(duì)黃酮提取的影響。

2.1.1 pH的影響 在酶解溫度為 50℃,酶解時(shí)間為1.5h,酶濃度為 0.1%的條件下,研究了具有不同 pH的 HAc-NaAc緩沖液對(duì)提取黃酮的影響。

從表 2中可以看出,隨著 pH的升高,提取得到的蘋果渣中粗黃酮量先升高,后下降。在 pH為 4.8時(shí),粗黃酮達(dá)到最高為 2.13g。提取率也隨著 pH的升高而提高,但是在 pH為 5.6時(shí)達(dá)到最大為 0.81%,故最佳 pH可以選擇 5.6。

表2 pH對(duì)黃酮提取的影響

2.1.2 酶濃度的影響 在選定酶解溫度 50℃,HAc-NaAc緩沖液 pH=5.6,酶解時(shí)間為 1.5h的條件下,研究酶濃度對(duì)黃酮提取的影響。由表 3可得出,在纖維素酶的用量為 0.2%時(shí),黃酮的提取率最高,為0.81%。因此,提取黃酮的纖維素酶的用量選用0.2%。

表3 酶濃度對(duì)黃酮提取的影響

2.1.3 酶解時(shí)間的影響 酶解時(shí)間對(duì)蘋果渣黃酮的提取也有一定影響。在 T=50℃、pH=5.6、E=0.2%時(shí),從表 4中可以看出,當(dāng)酶解 1h,黃酮的提取率最高可達(dá)到 1.10%。因此宜選用酶解時(shí)間為 1h。

表4 酶解時(shí)間對(duì)黃酮提取的影響

2.1.4 酶解溫度的影響 在 pH=5.6、t=1.0h、E= 0.2%條件下,酶解過程中分別采用不同的溫度進(jìn)行水浴,研究溫度對(duì)纖維素酶提取蘋果渣黃酮的影響。結(jié)果如表 5所示,在 40℃粗黃酮提取量最高,為 2.349g;而 50℃下提取的粗黃酮最低,為 2.193g。但是由于 40℃下蘋果渣中總黃酮的提取量較少,僅能達(dá)到 0.0205g,提取率為 0.87%;而 55℃下黃酮的提取率可達(dá)到 1.21%,因此最佳溫度選用55℃為宜。

表5 酶解溫度對(duì)黃酮提取的影響

2.1.5 正交實(shí)驗(yàn) 通過單因素實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn),酶用量、酶解時(shí)間、酶解 pH及酶解溫度對(duì)纖維素酶提取蘋果渣黃酮得率影響較大。且初步優(yōu)化工藝條件為：E=0.2%、T=55℃、pH=5.6,t=60m in。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表6。

表 8 化學(xué)法和酶法提取黃酮清除羥自由基活性的比較

表6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分析黃酮提取率正交實(shí)驗(yàn)表結(jié)果,可以發(fā)現(xiàn) A因素的 K2最大,B因素的 K3最大,C因素的 K3最大,D因素的 K1最大。因此,優(yōu)化工藝條件為A2B3C3D1,即纖維素酶用量 0.20%,pH=5.2,酶解溫度 60℃,酶解時(shí)間 80min。而總黃酮得率正交實(shí)驗(yàn)表結(jié)果表明,A因素的 K2最大,B因素的 K3最大,C因素的 K1最大,D因素的 K1最大。故最佳工藝為A2B3C1D1。由極差分析結(jié)果可以看出,影響黃酮提取率的因素主次順序?yàn)锳(酶濃度)→D(pH)→B(酶解溫度)→C(酶解時(shí)間)。而影響總黃酮得率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素主次順序?yàn)?A(酶濃度)→B(酶解溫度)→D(pH)→C(酶解時(shí)間)。

由于纖維素酶的價(jià)格比較昂貴,從工業(yè)生產(chǎn)及經(jīng)濟(jì)因素考慮,綜合上述分析得到優(yōu)化工藝條件為A2B3C1D1,即纖維素酶用量 0.2%,pH=5.2,酶解溫度60℃,酶解時(shí)間 40min。

2.2 酶法與化學(xué)法提取蘋果渣黃酮

2.2.1 不同方法提取總黃酮含量 在酶解工藝優(yōu)化條件(纖維素酶用量 0.2%、pH=5.2、酶解溫度 60℃、酶解時(shí)間 40min)下,纖維素酶酶解后提取得到的蘋果渣黃酮提取率為 1.26%,與乙醇提取法相比,增加了 2倍左右。提取得到的蘋果渣總黃酮量也有明顯的提高,由 0.0124g上升到 0.0291g,為乙醇提取得到的總黃酮量的兩倍左右,見表 7。

2.2.2 不同方法提取黃酮清除羥自由基活性 從表 8中可以看出,兩種方式所提取的黃酮,清除羥自由基活性極為相似,幾乎沒有差別,初步可以說明采用化學(xué)法或酶法所提取的黃酮的結(jié)構(gòu)和成分基本一致。同時(shí)從表 8中也可以看出,蘋果渣黃酮的清除羥自由基能力隨黃酮含量的增加而逐漸增強(qiáng),在濃度為 1.0mg/mL時(shí),其清除羥自由基活性分別能達(dá)到56.20%(化學(xué)法)和 56.43%(酶法),說明所提取的蘋果渣黃酮有較強(qiáng)的抗氧化能力。

表7 化學(xué)法和酶法的比較

3 結(jié)論

植物的細(xì)胞壁由纖維素組成,而有效成分往往被包裹在細(xì)胞壁內(nèi)。纖維素酶可以破壞細(xì)胞壁,從而使有效成分容易溶出[6]。本研究中先通過纖維素酶處理蘋果渣,再提取其中的黃酮類有效成分,結(jié)果表明,纖維素酶處理后的提取率明顯增加。并通過正交實(shí)驗(yàn)得到纖維素酶提取的優(yōu)化工藝條件為：pH =5.2、T=60℃、t=40min、E=0.2%。在優(yōu)化條件下,酶法提取黃酮的提取率可達(dá)到 1.26%,與乙醇提取法相比,黃酮提取率有明顯提高。

對(duì)提取黃酮進(jìn)行羥自由基清除實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)酶法與化學(xué)法提取黃酮成分清除能力相似,表明兩種方法提取黃酮物質(zhì)結(jié)構(gòu)可能一樣。說明纖維素酶酶解提取蘋果渣黃酮時(shí)并不破壞其中的有效成分,纖維素酶可用來提取蘋果渣黃酮。

由于中藥材存在質(zhì)地和成分的差異,因此將纖維素酶用于其廣泛的提取需要進(jìn)一步深入研究。

[1]任靜,李多偉,王童文 .超聲萃取蘋果渣中總黃酮工藝的研究[J].中成藥,2003,25(9)：761-762.

[2]馬田田 .纖維素酶用于中藥提取的初步研究 .中草藥, 1994,25(3)：123-139.

[3]馬桔云,趙晶巖,姜穎,等 .纖維素酶在黃連提取工藝中的應(yīng)用[J].中草藥,2000,31(2)：104.

[4]楊洋 .柚皮黃酮抗氧化機(jī)理及其含量的測定[J].廣西輕工業(yè),2002(1)：36-38.

[5]張靜麗,王宏勛,張雯,等 .靈芝,枸杞多糖復(fù)合抗氧化作用[J].食品與機(jī)械,2004,20(6)：11-12,46.

[6]馮曉萍,查忠勇,王槐三 .銀杏葉黃酮提取工藝研究現(xiàn)狀[J].四川化工與腐蝕監(jiān)控,2002,5(2)：13-17.

Study on extraction of flavanoid from apple pomace by cellulase and its antioxidation activities

WANG Yan-yan,L IU Tao,ZHANG Chong-yao,Y IN L in-lin,W U Guang-xu＊
(Life and Science College of Yangtze University,Jingzhou 434100,China)

In this p ap e r,the extrac tion cond itions of flavanoid from app le p om ace by ce llulose and its antioxida tion ac tivities we re inves tiga ted.The results showed tha t the yie ld of flavanoid from app le p om ace was highe r by us ing enzym e m e thod than by us ing trad itiona l chem ica lm e thod,the ob ta ining ra te of flavanoid inc reased from0.43% to 0.56%.In add ition,the orthogona l exp e r im entwas used to find the m os t suitab le extrac ted cond itions of flavanoid. And the op t im um cond itions we re as follows：ce llulase concentra tion was0.2%,pH was5.2,temp e ra ture and t im e for enzym e hyd rolys is was a t60℃ and40m in,resp ec tive ly.Unde r the op t im um cond itions,the extrac tion ra te of flavanoid from app le p om ace could reach1.26% by ce llulase,which was2.93t im es than tha t by us ing chem ica l m e thod.Add tiona lly,the extrac ted flavanoid us ing enzym a tic and chem ica l m e thods showed s im ila r antioxida tion ac tivity,which ind ica ted tha t ce llulase d id not des troy the comp onents of flavanoid.

ce llulase;flavanoid;app le p om ace

TS255.1

B

1002-0306(2010)02-0252-03

我國蘋果資源十分豐富,目前人們主要將其果肉用于飲料和釀造工業(yè),而對(duì)其副產(chǎn)品蘋果渣很少利用。根據(jù)分析蘋果渣中含有多種黃酮類化合物,黃酮類物質(zhì)有顯著的生理活性,如降血脂、降低膽固醇作用、清除自由基等,所以不斷將其應(yīng)用于醫(yī)藥及保健食品行業(yè)[1]。近年來,纖維素酶逐漸應(yīng)用于中草藥有效成分提取,如馬田田等[2]將纖維素酶用于黃柏小檗堿提取的預(yù)處理,小檗堿的收率可從 0.87%提高到 1.17%。本實(shí)驗(yàn)將纖維素酶用于蘋果渣黃酮的提取,以蘋果渣中提取的粗黃酮重量、總黃酮重量、提取率為指標(biāo),對(duì)纖維素酶提取蘋果渣黃酮的工藝條件進(jìn)行了初步優(yōu)化,為酶法提取中藥材提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2008-11-26 ＊通訊聯(lián)系人

王巖巖(1980-),女,碩士,講師,主要從事食品生物技術(shù)教學(xué)及研究工作。