宋婷，劉守金，方成武，梁益敏，張鵬，李衛(wèi)文

(安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥與資源實(shí)驗(yàn)室，安徽省中藥現(xiàn)代化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031)

*劉守金，E-mail：liushjin@hotmail.com

白毛夏枯草止咳化痰化學(xué)部位初步生物活性篩選

宋婷，劉守金*，方成武，梁益敏，張鵬，李衛(wèi)文

(安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥與資源實(shí)驗(yàn)室，安徽省中藥現(xiàn)代化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230031)

目的初步確定中藥白毛夏枯草鎮(zhèn)咳、祛痰作用的成分。方法白毛夏枯草的提取物依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，得到3個(gè)部位。小鼠被灌胃給予石油醚部位2.1g·kg-1,醋酸乙酯部位1.47g·kg-1,正丁醇部位1.71g·kg-1，記錄濃氨水引起小鼠咳嗽的潛伏期和5min內(nèi)的咳嗽次數(shù)。此外，計(jì)算小鼠呼吸道排出的酚紅量。同時(shí)，通過3個(gè)部位的HPLC圖譜的色譜峰平行比較其化學(xué)成分。結(jié)果3個(gè)部位中的醋酸乙酯部位能顯著延長(zhǎng)潛伏期，減少咳嗽次數(shù)，同時(shí)增加酚紅的排出量。而且，木犀草素和芹菜素被證實(shí)存在在這個(gè)部位。結(jié)論白毛夏枯草醋酸乙酯部位有鎮(zhèn)咳、祛痰作用，其中含有的木犀草素和芹菜素可能是其中的2個(gè)活性成分。

鎮(zhèn)咳；祛痰；高效液相色譜

白毛夏枯草為唇形科筋骨草屬植物金瘡小草AjugadecumbensThunb.的干燥全草，又稱筋骨草；藥用始載于《本草拾遺》，具有清熱解毒，祛痰止咳，涼血止血的功效。用于治療肺熱咳嗽，咽喉腫痛，癰腫瘡癤等癥。白毛夏枯草的主要成分有黃酮類、二萜類、有機(jī)酸、酚性類等，現(xiàn)代藥理研究表明，白毛夏枯草具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘[1-4]、抗炎、抑制支氣管病毒[5]、抗肺纖維化[6]、保肝利膽[7]，抑制I型變態(tài)反應(yīng)和促進(jìn)免疫作用[8]。現(xiàn)在以單味筋骨草部分粉碎、部分乙醇提取物，經(jīng)混合而制成片劑和膠囊制劑，主要用于治療急慢性支氣管炎、肺膿瘍等癥，已經(jīng)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》第十九冊(cè)[9]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用小鼠鎮(zhèn)咳、祛痰試驗(yàn)對(duì)白毛夏枯草乙醇粗提物的石油醚、醋酸乙酯和正丁醇3個(gè)萃取部位進(jìn)行藥效比較，結(jié)合高效液相色譜法對(duì)3個(gè)化學(xué)部位的色譜峰進(jìn)行分析，以初步探討白毛夏枯草中起鎮(zhèn)咳、祛痰作用的有效化學(xué)部位，為進(jìn)一步優(yōu)化白毛夏枯草制劑生產(chǎn)工藝，提高質(zhì)量控制水平，提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1試藥

可待因(青海制藥廠有限公司，30mg/片，批號(hào)20051002)；酚紅，分析純(上海展云化工有限公司，批號(hào)20080625)；木犀草素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)11520-200504)；芹菜素對(duì)照品(純度99.2%，本實(shí)驗(yàn)室自制)；乙醇，石油醚，醋酸乙酯，正丁醇，氯化銨，氨水等實(shí)驗(yàn)所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；白毛夏枯草藥材于2008年3月采自安徽合肥大蜀山，原植物由劉守金教授鑒定為唇形科筋骨草AjugadecumbensThunb.，憑證標(biāo)本(HF080330)存于安徽中醫(yī)學(xué)院標(biāo)本館(ACM)。

1.2動(dòng)物

昆明種小鼠，體重18～22g，雌雄各半，由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SPF級(jí)，合格證號(hào)：SCXK(皖)2005-001。

1.3儀器

島津LC-20AB型高效液相色譜儀，SPD-M20A型檢測(cè)器(日本島津公司)；島津LCSolutionN2010色譜工作站；KQ-50型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器廠)；UV752CRT型紫外可見分光光度計(jì)(上海棱光儀器公司)；402AI超聲霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療責(zé)任有限公司)。

2 方法

2.1白毛夏枯草化學(xué)部位分離制備

白毛夏枯草藥材5250g，依次用95%乙醇、50%乙醇浸泡過夜，加熱回流提取，每個(gè)濃度提取2次，首次2h，第2次1h，合并提取液，回收乙醇，濃縮至膏狀無(wú)醇味，得到黑色稠狀物1633.12g，加入等量的水混勻，依次用石油醚(60～90℃)、醋酸乙酯以及正丁醇萃取，萃取液回收溶劑，并濃縮得到3個(gè)萃取部位。其中石油醚部位110.50g，醋酸乙酯部位77.22g，正丁醇部位89.60g，3個(gè)部位分別占藥材量的2.10%，1.47%，1.71%。

2.2藥效學(xué)考察

2.2.1鎮(zhèn)咳實(shí)驗(yàn)[10]取昆明種小鼠,雌雄各半，隨機(jī)分成5組，分別灌胃給予生理鹽水20mL·kg-1、石油醚提取物2.1g·kg-1、醋酸乙酯提取物1.47g·kg-1、正丁醇提取物1.71g·kg-1和可待因50mg·kg-1，給藥30min后將小鼠放入600mL的玻璃瓶?jī)?nèi)，用402AI超聲霧化器向瓶?jī)?nèi)噴濃氨水30s，取出小鼠觀察并記錄小鼠咳嗽潛伏期和5min內(nèi)的咳嗽次數(shù)。小鼠咳嗽表現(xiàn)為以其腹肌收縮，同時(shí)張大嘴為準(zhǔn)。

2.2.2祛痰實(shí)驗(yàn)[10]取昆明種小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分成5組，分別灌胃給予生理鹽水20mL·kg-1、石油醚提取物2.1g·kg-1、醋酸乙酯提取物1.47g·kg-1、正丁醇提取物1.71g·kg-1和氯化銨1g·kg-1，30min后，分別給各小鼠腹腔注射5%酚紅10mL·kg-1，給予酚紅30min后頸椎脫臼處死小鼠，解剖小鼠，剝?nèi)夤苤車M織，剪下自甲狀軟骨下至氣管分支處的一段氣管，放入盛有2mL生理鹽水的試管中再加1mol·L的NaOH0.1mL，搖勻放置2h，使氣管的色素溶出，用752型紫外可見分光光度計(jì)于波長(zhǎng)546nm處測(cè)吸光度A值，根據(jù)酚紅標(biāo)準(zhǔn)液管的A值作出回歸方程，從而計(jì)算出酚紅排出量。

2.3HPLC指紋圖譜分析

2.3.1色譜條件BIOSILU546250-1型色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)；流動(dòng)相采用二元體系：A為水，B為甲醇，梯度洗脫程序?yàn)?min(10%B)、20min(40%B)、30min(40%B)、40min(65%B)、50min(65%B)、60min(75%B)、70min(75%B)、80min(80%B)、90min(80%B)；柱溫：30℃；流速：1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：336nm；進(jìn)樣量：20μL。

2.3.2供試品溶液制備

2.3.2.1對(duì)照品溶液制備 精密稱取木犀草素對(duì)照品1.3mg、芹菜素對(duì)照品1.0mg，分別加入甲醇溶解，定容至10mL的容量瓶中，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取濾液，即得對(duì)照品溶液。

2.3.2.2化學(xué)部位溶液制備 取石油醚萃取部位浸膏6.47mg、醋酸乙酯萃取部位浸膏6.59mg和正丁醇萃取部位浸膏6.41mg，分別加入10mL甲醇，定容至10mL的容量瓶中，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取濾液，即得有效部位溶液。

3 結(jié)果

3.1白毛夏枯草3個(gè)化學(xué)部位的鎮(zhèn)咳作用比較

結(jié)果見表1。白毛夏枯草3個(gè)部位與模型組相比較，石油醚部位不能顯著延長(zhǎng)小鼠咳嗽的潛伏期，減少咳嗽次數(shù)(與模型組相比P>0.05)，正丁醇部位只可以明顯減少小鼠的咳嗽次數(shù)(P<0.05)，而醋酸乙酯部位對(duì)濃氨水引起的小鼠咳嗽有明顯的抑制作用(P<0.05)。

表1 白毛夏枯草提取物對(duì)小鼠的鎮(zhèn)咳作用

注：(1)n=10；(2)與模型組相比,*P<0.01；(3)與醋酸乙酯提取物組相比，aP<0.05

3.2白毛夏枯草3個(gè)化學(xué)部位祛痰作用的比較

結(jié)果見表2。與模型組相比,石油醚與正丁醇部位對(duì)小鼠的酚紅排出量有所增加，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，均沒有顯著差異(P>0.05)；醋酸乙酯部位能顯著增加酚紅排出量(P<0.05)，具有明顯的祛痰作用。

表2 白毛夏枯草提取物對(duì)小鼠的祛痰作用

注：(1)n=8；(2)與模型組相比,*P<0.05；(3)與醋酸乙酯提取物組相比，aP<0.05

3.3指紋圖譜比較

3.3.1化學(xué)部位HPLC圖譜比較 按照2.3.1的色譜條件進(jìn)行分析，分別得到白毛夏枯草藥材石油醚萃取部位、醋酸乙酯萃取部位以及正丁醇萃取部位的指紋圖譜，結(jié)果見圖1～3。

圖1 白毛夏枯草石油醚萃取部位的HPLC圖

圖2 白毛夏枯草醋酸乙酯萃取部位的HPLC圖

圖3 白毛夏枯草正丁醇萃取部位的HPLC圖

由圖1～3可知，石油醚部位的色譜峰主要集中在40～50min以及60～80min，40～50min的色譜峰響應(yīng)值在5左右，60～80min出現(xiàn)的色譜峰響應(yīng)值在10左右；醋酸乙酯部位的色譜峰主要集中在40～50min，色譜峰響應(yīng)值在100左右；正丁醇部位的色譜峰主要集中在20～50min，色譜峰響應(yīng)值在50左右。

3.3.2對(duì)照品與醋酸乙酯萃取部位HPLC圖譜比較 見圖4。

圖4 木犀草素、芹菜素的HPLC圖譜

由圖4可知，醋酸乙酯萃取部位的色譜峰集中在40～50min，1號(hào)峰、2號(hào)峰為40～50min的兩個(gè)主要峰，保留時(shí)間分別為46.20min、48.90min。其中1號(hào)峰和2號(hào)峰分別為木犀草素和芹菜素。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)白毛夏枯草的乙醇提取物進(jìn)行有效部位研究，結(jié)果顯示白毛夏枯草乙醇提取物的石油醚、醋酸乙酯和正丁醇3個(gè)部位的HPLC指紋峰存在明顯的區(qū)別；小鼠的鎮(zhèn)咳、祛痰實(shí)作用實(shí)驗(yàn)表明醋酸乙酯部位的鎮(zhèn)咳、祛痰作用顯著優(yōu)于石油醚與正丁醇部位，提示白毛夏枯草乙醇提取物的醋酸乙酯部位可能為活性部位。

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PreliminaryBioactivity-screeningandCharacterizationofAnti-tussiveandExpectorantConstituentsofAjugaDecumbens

Song Ting, Liu Shoujin, Fang Chengwu, Liang Yimin, Zhang Peng, Li Weiwen

(LabofTraditionalChineseMedicineandresourceAnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine,College
ofpharmacy,AnhuiKeylabofmodernizationofTraditionalChineseMedicine,HefeiAnhui230031,China)

Objective: To identify potential anti-tussive and expectorant constituents ofAjugadecumbens, a traditional Chinese medicine.MethodsThree factions were separated with petroleum ether, ethyl acetate,

and n-butyl alcohol from crude alcohol extract of . The latency and frequency of coughs within min were counted in mice induced by ammonia water, after oral administration of the three factions at single doses of .g·kg, .g·kg, and .g·kg, respectively. Besides, amount of Phenol red secreted from respiratory tract was sampled. Meantime, the finger-prints of the three factions were profiled by HPLC to compare the chemical compositions in parallel. : Among the three factions, the ethyl acetate faction significantly elongated latency and cut down frequency, as well as to increase the secretion of phenol red. Moreover, luteolin and apigenin have been confirmed present in the active ethyl acetate faction. : The ethyl acetate faction of may exert effects, in which luteolin and apigenin were likely to be bio-active components.

Antitussis；Expectorant；High performance liquid chromatography

--)