李悠悠，陳圣鋒，王友華，田振軍

不同強度運動對大鼠冠狀動脈CGRP、ET-1和NOS表達的影響

李悠悠，陳圣鋒，王友華，田振軍

目的：探討運動對大鼠冠狀動脈降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）、內(nèi)皮素（ET-1）和一氧化氮合酶（NOS）表達的影響。方法：健康雄性SD3月齡大鼠24只，分為安靜對照組、小強度運動組和大強度運動組，運動組采用大鼠跑臺運動方式，建立大鼠不同強度運動模型，運用免疫組織化學SABC法研究不同強度運動對大鼠冠狀動脈CGRP、ET-1、神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）表達的影響。結(jié)果：與安靜對照組比較，小強度運動組和大強度運動組CGRP、nNOS、iNOS和eNOS均顯著性升高，小強度運動組ET-1顯著降低，大強度運動組ET-1顯著性升高。與小強度運動組比較，大強度運動組CGRP、ET-1、nNOS、iNOS和eNOS的表達變化均有顯著性差異。小強度運動組和大強度運動組ET-1/CGRP和ET-1/NOS比值均低于安靜對照組。結(jié)論：運動可引起大鼠冠狀動脈CGRP、ET-1及NOS的表達變化，且與運動強度關(guān)系密切。因此認為，不同強度運動引起ET-1/CGRP和ET-1/NOS比值的變化可能是運動引起心血管生物功能改變的因素之一。

運動訓練；冠狀動脈；降鈣素基因相關(guān)肽；免疫組織化學；血管內(nèi)皮細胞

冠狀動脈結(jié)構(gòu)與功能重塑決定著心臟的供血狀況。冠狀動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）及梗塞可直接引起心肌缺血或?qū)е滦募」Ｋ繹1-2]，是心源性猝死的主要原因[3-4]，其病理機制主要通過機械刺激、高血脂、高血糖以及內(nèi)分泌等因素導致冠狀動脈血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖和血管內(nèi)皮細胞（vascular endothelial cell，VEC）功能紊亂[5-6]；循環(huán)系統(tǒng)和冠狀動脈局部VSMC和VEC可分泌CGRP、ET-1和NOS并可通過內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌等途徑作用于VSMC和VEC，引起冠狀動脈結(jié)構(gòu)與功能的重塑。CGRP可拮抗ET-1引起的VSMC增殖和縮血管效應(yīng)，防止冠狀動脈增厚，保護血管損傷[7-8]，而NO可抑制VSMC增殖和冠狀動脈舒張反應(yīng)[9]。目前，關(guān)于病理條件下冠狀動脈結(jié)構(gòu)與功能變化及其機制研究報道較多[10-11]。有關(guān)生活方式干預(yù)重塑冠狀動脈結(jié)構(gòu)與功能的研究，已引起學者的高度關(guān)注[12]，但生活方式干預(yù)包括運動鍛煉時間、強度及其重塑冠狀動脈結(jié)構(gòu)與功能的機制研究報道尚少見。積極探討運動鍛煉干預(yù)引起冠狀動脈CGRP、ET-1和NOS的研究將對運動重塑冠狀動脈結(jié)構(gòu)與功能提供實驗依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 動物分組與運動訓練

健康雄性SD大鼠24只（3月齡，實驗動物購自陜西省中醫(yī)研究院實驗動物中心，動物質(zhì)量合格證號：陜醫(yī)動證字07-004號），體重（246.8±3.4）g，國家標準嚙類動物飼料常規(guī)分籠喂養(yǎng)每籠4只，自由飲食，動物室內(nèi)溫度為17℃～23℃，相對濕度為（40～60）%。隨機分為正常對照組，小強度運動組和大強度運動組，每組8只。對照組正常籠內(nèi)喂養(yǎng)，不運動。小強度運動組和大強度運動組采用遞增強度方式進行跑臺運動（采用杭州段氏專用大鼠電動鼠籠跑臺），運動負荷參照Bedford的研究進行[13]。小強度運動組訓練5 d/wk，共持續(xù)訓練8wk。起始速度為15 m/min，持續(xù)時間為20 min。遞增速度為3 m/min、遞增時間為5 min，運動至速度為20 m/min時，增加跑臺坡度5%，總時間為60 min。大強度運動組訓練6 d/wk，共持續(xù)訓練8wk。遞增速度為3 m/min、遞增時間為5 min，運動至速度為35 m/min時，增加跑臺坡度10°，總時間為60 min。整個訓練過程可用電刺激來強迫大鼠進行跑臺訓練（電刺激<1 mA）。

1.2 取材、樣本制備與免疫組化實驗

20%烏拉坦腹腔麻醉，迅速開胸摘取心臟后迅速在冷生理鹽水中涮洗淤血，中性甲醛液固定，石蠟包埋，切片（厚5.0 μm，切片機為RM2126，德國LEICA公司），常規(guī)脫蠟至水后用于免疫組織化學實驗。

免疫組化實驗采用SABC法，按照試劑盒說明書操作步驟進行。切片用去離子水沖洗，3%H2O2封閉，經(jīng)微波抗原修復(fù)15 min，PBS沖洗，加生物素封閉液A 10 min，滴加正常非免疫血清，滴加一抗（CGRP、ET-1、eNOS、nNOS和iNOS均為1∶100，兔抗小鼠、大鼠、人多克隆抗體，博士德公司），4℃過夜，復(fù)溫，PBS沖洗，滴加二抗，PBS沖洗，滴加SABC，Tween、PBS液洗2 h，DAB顯色，常規(guī)脫水透明，封片。每次染色設(shè)陰性對照，PBS取代一抗。

1.3 數(shù)據(jù)采集與分析

采用BX51 Olympus光學顯微鏡拍照，運用低倍與高倍相結(jié)合的辦法，低倍選準位置（選擇左、右心室游離壁心外膜下的心室肌淺層冠狀動脈橫切處），高倍觀察并拍照，采用Olympus顯微圖像分析系統(tǒng)，手工選取冠狀動脈橫切面并測定其平均光密度值（Mean optical density，MOD），MOD值越大表明陽性表達越強。結(jié)果以平均數(shù)±標準差（X±S）表示，所有數(shù)據(jù)采用SPSS軟件分析，組間比較采用單因素方差分析（One-Way，ANOVA）。顯著性差異選擇P<0.05和P<0.01水平。

2結(jié) 果

2.1 運動訓練大鼠冠狀動脈CGRP與ET-1表達的變化

光鏡下觀察到冠狀動脈VEC和VSMC胞漿陽性顆粒呈棕色或棕黃色。與安靜對照組比較，小強度運動組和大強度運動組CGRP的MOD值均顯著性升高；ET-1的MOD值小強度運動組顯著性降低，大強度運動組顯著性升高。大強度運動組CGRP和ET-1的表達變化與小強度運動組比較，均有顯著性差異。小強度運動組和大強度運動組ET-1/CGRP比值均小于安靜對照組（見圖1、圖2、表1）。

圖1 運動訓練大鼠冠狀動脈CGRP的表達，×400Figure 1 Expression of the CGRP in exercise training rat coronary artery，×400

圖2 運動訓練大鼠冠狀動脈ET-1的表達，×400Figure 2 Expression of the ET-1 in exercise training rat coronary artery，×400

表1 運動訓練大鼠冠狀動脈CGRP和ET-1表達及ET-（1M/COGDR，Pn=比8）Table 1 The compa值ris變on化 o的f C比G較RP and ET-1 express and ET-1/CGRP ratio changes on exercise training rats coronary artery

2.2 運動訓練大鼠冠狀動脈NOS表達的變化

光鏡下觀察到冠狀動脈VEC和VSMC胞漿陽性顆粒呈棕色或棕黃色。與安靜對照組比較，小強度運動組和大強度運動組NOS的MOD值均顯著性增加，但iNOS和eNOS的MOD值比nNOS表達的增加趨勢更顯著。大強度運動組NOS的表達變化與小強度運動組比較，均有顯著性差異。小強度運動組和大強度運動組ET-1/NOS低于安靜對照組（見圖3-圖5、表2）。

圖3 運動訓練大鼠冠狀動脈nNOS的表達，×400Figure 3 Expression of the nNOS in exercise training rat coronary artery，×400

圖4 運動訓練大鼠冠狀動脈iNOS的表達，×400Figure 4 Expression of the iNOS in exercise training rat coronary artery，×400

圖5 運動訓練大鼠冠狀動脈eNOS的表達，×400Figure 5 Expression of the eNOS in exercise training rat coronary artery，×400

表2 運動訓練大鼠冠狀動脈NOS表達和ET-1/NOS比（M值O變D，化n=的8）Table 1 The comparison比 of較 3 NOS isoforms express and ET-1/NOS ratio changes on exercise training rats coronary artery

3 分析與討論

3.1 運動引起冠狀動脈CGRP和ET-1表達變化分析

CGRP是目前已知的最強的舒血管物質(zhì)之一，對心血管系統(tǒng)起著重要的生理調(diào)節(jié)作用。CGPR的結(jié)合位點幾乎全集中于血管內(nèi)層，具有強大的擴張冠狀動脈作用，其舒張血管作用不完全依賴于VEC的完整性。CGRP可刺激VEC增殖進而促進血管修復(fù)，對VSMC增殖有抑制作用并可使VSMC從合成表型向收縮表型轉(zhuǎn)化[14]，對改善病變冠脈有重要意義。運動對機體CGRP影響的報道目前多集中于骨骼肌和脊髓背根神經(jīng)節(jié)，關(guān)于運動對冠狀動脈CGRP影響的報道少見。運動是影響機體CGRP釋放的主要因素之一[15]，健康人在運動時血漿CGRP水平升高，對冠脈循環(huán)改善起重要調(diào)節(jié)作用[16]，因此認為，運動可以升高CGRP擴張血管、緩解AS時血管彈性降低和心肌供血減少的狀況。目前認為，CGRP對冠脈擴張作用的可能機制為直接擴張作用，或通過激活VSMC上K+-ATP通道來實現(xiàn)，或通過胞內(nèi)cAMP介導，或與CGRP維持細胞內(nèi)Ca2+濃度穩(wěn)定而降低細胞膜Ca2+通透性[17-18]。本文實驗發(fā)現(xiàn)，小強度運動大鼠冠狀動脈CGRP的表達顯著升高，提示小強度運動通過加快血流刺激冠脈VEC促進CGRP的釋放，引起冠脈擴張從而保證心臟血供；而大強度運動大鼠CGRP的降低可能是因為大強度運動導致冠狀動脈結(jié)構(gòu)損傷所致。大強度運動可以導致機體ET-1分泌增加[19]，在一定程度上反饋抑制了CGRP的釋放；另外，大強度運動導致機體兒茶酚胺增加，也可抑制CGRP的分泌[20]。因此認為小強度運動改善心功能與冠狀動脈CGRP表達增加有關(guān)。

運動訓練對冠狀動脈ET-1表達的影響已有不少文獻報道，ET-1是目前最強的冠脈收縮物質(zhì)，可促進冠脈VSMC的增殖和遷移，調(diào)制該進程有可能引發(fā)AS。運動訓練可減弱冠脈VSMC的表型變化。Jones等證實，運動訓練可降低冠脈VSMC對ET-1的敏感性[21]。Wamhoff等報道，16～20周的跑臺耐力訓練后，冠脈VSMC對促有絲分裂劑誘導的表型變化敏感性降低，其機制可能是運動訓練通過SERCA途徑，增強核Ca2+的調(diào)控[22]。VEC是合成和釋放ET-1的主要部位[23]，在AS斑塊中ET-1水平呈顯著性升高[7]。因此，ET-1升高被認為是VEC受損的重要指標，VEC功能異常又是AS形成的早期表現(xiàn)。已有實驗表明，運動訓練可增強VEC的功能[24]；對冠心病患者進行12周的康復(fù)運動后，發(fā)現(xiàn)ET-1水平明顯下降[25]，推測ET-1水平的下降可能是運動阻止冠狀動脈病理形成和減輕病變嚴重程度的機理之一。適宜的運動可控制VEC對ET-1的合成和釋放，從而降低ET-1水平，這可能是運動對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生有益影響的生理學基礎(chǔ)。而過度訓練可使血漿ET-1水平升高，此時VEC釋放大量ET-1引起血管收縮，甚至使VEC增生[26]。本實驗發(fā)現(xiàn)，小強度運動大鼠冠狀動脈ET-1顯著降低，而大強度運動使ET-1顯著升高，進一步證實了上述觀點。

ET-1與CGRP對血管有強烈持久的相互拮抗效應(yīng)，CGRP濃度降低時ET-1則上升引起血管收縮，而ET-1降低時CGRP升高導致血管擴張。研究表明，CGRP能抑制病理條件下ET-1的大量釋放，但不影響血漿ET-1的基礎(chǔ)含量及離體血管條ET-1的基礎(chǔ)釋放。表明CGRP對心血管疾病的治療作用可能與它拮抗ET-1的生物效應(yīng)有關(guān)。運動應(yīng)激可增加冠狀動脈CGRP合成與釋放[16]，推測增加的CGRP可拮抗ET-1縮血管效應(yīng)，對冠脈疾病起到一定保護作用。ET-1/CGRP的比值對血管舒/縮的調(diào)節(jié)起重要作用[27]。本文實驗表明，小強度運動大鼠ET-1/CGRP的比值降低；大強度運動較小強度運動ET-1/CGRP的比值升高。提示，小強度運動升高血壓，刺激CGRP的合成與釋放增加，抑制ET-1的大量釋放，從而拮抗ET-1的縮血管效應(yīng)，對冠狀動脈產(chǎn)生保護作用。

3.2 運動訓練引起冠狀動脈NOS表達變化分析

研究表明，NO可維持血管舒張，影響血管重塑，對防止心血管疾病起重要作用[28]。NOS是NO合成唯一的限速酶，NOS活性可間接反映NO的生成情況。運動增加冠狀動脈內(nèi)皮依賴性舒張作用，主要是通過增加eNOS表達水平和NO合成量實現(xiàn)的[29]。小強度運動可增加血管壁面切應(yīng)力，誘導eNOS表達上調(diào)，從而增加VEC的NO產(chǎn)量和（或）提高VSMC的NO生物利用度，繼而發(fā)揮其保護心血管作用[30]。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)，小強度運動后大鼠胸主動脈eNOS的表達顯著性增加[31]，此結(jié)果在冠狀動脈中也得到證實。提示，小強度運動使血管nNOS和eNOS活性增強，NO合成量增加，促進內(nèi)皮依賴性的舒張反應(yīng)是運動抵抗多種心血管疾病的機制之一。NO適量合成對機體產(chǎn)生有益的影響，但大量的NO合成不僅會引起強烈的血管舒張，導致血壓降低而抑制心臟功能，還會產(chǎn)生細胞毒性作用。研究表明，NO分泌與管壁切應(yīng)力有關(guān)，運動使管壁切應(yīng)力增大，激活了VEC表面的機械性感受器，使NOS活性增強，產(chǎn)生更多NO[32]。iNOS一旦被誘導合成即可持續(xù)產(chǎn)生大量NO，直至底物耗竭，在L-Arg不足時，NOS生成超氧離子損害VEC，引起AS的發(fā)生與發(fā)展。另外，ET-1大量增加除了引起血管收縮外，還可通過作用于ET-R激活NOS，導致NO合成增加[33]。本文實驗發(fā)現(xiàn)，大強度運動大鼠冠狀動脈NOS表達均顯著性增加，且iNOS和eNOS增加幅度更大，推測小強度運動刺激NOS的表達對機體產(chǎn)生良好影響；大強度運動可誘導冠狀動脈VEC產(chǎn)生過量的NOS，進而產(chǎn)生大量氮自由基，引起VEC損傷和VSMC增殖，可能是大強度運動引起心血管功能降低的生物學因素之一。

研究證明，AS形成過程中始終存在ET-1/NOS平衡失調(diào)，ET-1/NOS比值升高在AS的形成及發(fā)展中十分重要[34]。本文研究發(fā)現(xiàn)，小強度運動大鼠冠狀動脈的ET-1/NOS比值降低，推測可能是通過減少NO的降解和合成抑制，并通過抑制ET-1合成、釋放以及釋放后的作用等機制，導致ET-1/NOS比值下調(diào)，從而達到保護內(nèi)皮功能而表現(xiàn)為抗AS作用；大強度運動大鼠冠狀動脈ET-1/NOS的比值上調(diào)，內(nèi)皮功能紊亂，可能是引起心血管功能降低的生物學因素之一。

4結(jié) 語

運動可引起大鼠冠狀動脈CGRP、ET-1及NOS表達發(fā)生變化，且與運動強度關(guān)系密切；小強度運動可使冠狀動脈CGRP和NOS表達適度增加且抑制ET-1的表達；大強度運動導致大鼠冠狀動脈ET-1和NOS過量表達，且抑制CGRP的釋放；不同強度運動引起ET-1/CGRP與ET-1/NOS的比值變化是運動引起心血管生物功能改變的因素之一。小強度運動可以舒張血管，對高血壓和冠狀動脈粥樣硬化等心血管疾病危險因素具有積極的預(yù)防和治療作用。

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Effect of Different Exercise Intensity on Expression of CGRP,ET-1 and NOS in the Coronary Artery of Rats

LI Youyou,CHEN Shengfeng,WANG Youhua,TIAN Zhenjun
(School of PE,Shaanxi Normal University,Xi'an 710062,China)

Objective:To discuss the effect of different exercise intensity on expressions of calcitonin gene-related peptide(CGRP),endothelin-1(ET-1)and nitric oxide synthase(NOS)in the rat coronary artery.Methods:Healthy 3-month male SD rats(n=24)were divided into the control group,small-intensity exercise group and high-intensity exercise group.Exercise group used treadmill exercise to establish the models of small-intensity exercise group and the high-intensity exercise group rats.Immunohistochemistry of SABC was used to measure different exercise intensity of coronary artery CGRP,ET-1,nNOS, iNOS,and eNOS expression of rats.Results:Comparing with the control group,the expressions of CGRP and NOS isoforms in the small-intensity exercise group and the high-intensity exercise group increased significantly,ET-1 expression reduced obviously in the small-intensity exercise group,the ET-1 level of the high-intensity exercise group considerably elevated.The change of the coronary artery CGRP,ET-1and NOS expression in the high-intensity exercise group compared with the small-intensity exercise group were significant.The rate of ET-1/CGRP and ET-1/NOS in the groups of small-intensity and high-intensity exercise were lower than the control group.Conclusions:Exercise can induce expression change of CGRP,ET-1 and NOS isoforms in coronary artery,and the close relationship with exercise intensity.Therefore the exercise training causes the ET-1/CGRP ratio and ET-1/NOS ratio change is one of the factors that exercise-induced the cardiovascular biological function change.

exercise training;coronary artery;calcitonin gene-related peptide;immunohistochemistry;vascular endothelial cells

G 804.4

A

1005-0000（2010）01-0041-04

2009-07-01；

2009-11-18；錄用日期：2009-11-19

教育部博士學科點基金（項目編號：20050718011）；陜西師范大學“211工程”重點建設(shè)學科——運動生物學重點學科建設(shè)項目。

李悠悠（1987-），女，河南焦作人，陜西師范大學在讀碩士研究生。通訊作者：田振軍（1965-），男，陜西綏德人，陜西師范大學教授，博士生導師。

陜西師范大學體育學院，西安710062。