周艷芳，胡迎春，楊海鷺，徐 怡，歐陽靜萍

(1.廣東醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，廣東 東莞 523808;2.武漢大學(xué)病理生理教研室，湖北 武漢 430071)

心肌成纖維細(xì)胞的異常增殖、過度合成和分泌大量的膠原蛋白是心肌纖維化形成的細(xì)胞學(xué)本質(zhì)[1]。因此，深入研究間質(zhì)重構(gòu)與心肌成纖維細(xì)胞增殖、膠原合成的關(guān)系，尋找合適的藥物抑制間質(zhì)重構(gòu)，對于逆轉(zhuǎn)心肌纖維化、提高心血管功能具有重要的理論意義和臨床價值。筆者采用容量負(fù)荷因子醛固酮誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成，觀察苦參堿對心肌成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的影響并探討轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)蛋白在苦參堿抗心肌纖維化中的作用機(jī)制，為臨床使用有效藥物預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Bio-Rad 450型酶標(biāo)儀(美國伯樂Bio-Rad公司);UV 1601分光光度計(日本島津);PCR儀(華美生物工程公司);DY-8A型電泳儀(上海西巴斯生物技術(shù)開發(fā)公司);DMBRI倒置相差熒光顯微鏡(德國LEICA);FACSort型流式細(xì)胞儀(美國Becton-Dickinson公司)。DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);新生小牛血清(Gibco公司);醛固酮(Sigma公司);胰蛋白酶(Difco);小鼠抗波形蛋白單克隆抗體(Biogenes公司);TGF-β1單抗(Biogenes公司);FITC-羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司);羥脯氨酸測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma公司)。其他常用生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 差速貼壁法體外培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞

取日齡1～3d的Wistar大鼠，在無菌條件下開胸取出心臟，置4℃ 0.01%磷酸鹽緩沖液中，剪取心室肌至1mm3大小的碎塊，棄去0.01%磷酸鹽緩沖液，加入0.125%胰蛋白酶8～10mL反復(fù)消化10min，直至組織塊消失，分別收集每次消化懸液，離心棄上清液，加入含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，置37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中。根據(jù)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞貼壁時間的不同，采用差速貼壁1～1.5h，棄上清液，獲得心肌成纖維細(xì)胞。待細(xì)胞長滿瓶壁后用0.25%胰酶消化傳代。抗波形蛋白單克隆抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色對鑒定為所需的心肌成纖維細(xì)胞純度達(dá)98%。試驗(yàn)采用2～3代的成纖維細(xì)胞。各組處理因素作用24h后，光學(xué)倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。

1.3 試驗(yàn)分組

對照組:不加任何處理因素;醛固酮組:培養(yǎng)液中加入醛固酮1.0×10-7mol/L;醛固酮+不同濃度苦參堿組:培養(yǎng)液中同時加入1.0×10-7mol/L的醛固酮和濃度分別為0.125，0.25，0.5mmol/L的苦參堿。將上述各組依次標(biāo)記為A，B，C，D，E組。

1.4 測定指標(biāo)

加處理因素24h后，在已培養(yǎng)細(xì)胞的96孔板每孔中加入0.5%MTT10μL，置37℃下4h后，棄上清液，加入100μL二甲基亞砜(DMSO)振蕩15min，置酶標(biāo)儀上測光密度 (OD)值，測定波長為490nm。

用流式細(xì)胞儀雙標(biāo)法測定細(xì)胞周期及TGF-β1蛋白表達(dá)。處理因素作用24h后收集細(xì)胞，加70%冷乙醇4℃過夜。離心，磷酸鹽緩沖液沖洗，加入一抗4℃孵育過夜，用磷酸鹽緩沖液沖洗，加入異硫氰酸熒光束(FITC)標(biāo)記的二抗37℃孵育30min。RNA酶200μL37℃水浴30min。碘化丙啶暗處冰浴30min。

用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測TGF-β1蛋白表達(dá)。處理因素作用24h后，磷酸鹽緩沖液沖洗，純甲醇固定10min，1%TritonX-100室溫孵育20min。正常山羊血清室溫封閉10min;滴加一抗置濕盒4℃過夜;磷酸鹽緩沖液洗3次;滴加FITC標(biāo)記二抗，置37℃濕盒中1h，磷酸鹽緩沖液洗3次，每次5min;觀察，照相。

取各組細(xì)胞上清液0.5mL，加無水乙醇1.2mL，旋渦混勻器充分混勻2次，每次2min，3500r/min離心10min，取上清液約1.5mL，烘干，加0.5mL雙蒸水復(fù)溶，制成稀釋1倍的檢測液，加試劑一、二、三(具體操作按羥脯氨酸檢測試劑盒說明書)混勻，65℃水浴15min，冷卻后在酶標(biāo)儀上測 OD值，測定波長為550nm，光徑1cm，雙蒸水調(diào)零，比色。按照下式計算羥脯氨酸含量。

羥脯氨酸=(測定管吸光度-空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(5μg/mL)×稀釋倍數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示，使用SPSS統(tǒng)計軟件分析，組間比較采用 t檢驗(yàn)和方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下心肌成纖維細(xì)胞生長形態(tài)的改變

對照組細(xì)胞較大，胞漿豐富，呈梭形，細(xì)胞間連接豐富;醛固酮組細(xì)胞增生活躍，呈編織狀，胞體增大，細(xì)胞生長密集。與醛固酮組比較，加入不同濃度苦參堿后，細(xì)胞生長受到不同程度的抑制，體積縮小，細(xì)胞數(shù)目明顯減少，且隨苦參堿濃度增大，生長抑制更加明顯，部分細(xì)胞變圓，透光度減低(圖1)。

圖1 各組心肌成纖維細(xì)胞生長形態(tài)(×200)

2.2 各組細(xì)胞增殖情況

A組MTT-OD值為0.2104±0.0221，B組為0.3696±0.0304，C組為0.3328±0.0304，D組為0.2718±0.0252，E組為0.1974±0.0152?？梢?，與對照組比較，醛固酮組MTT-OD值明顯升高，提示醛固酮能明顯促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖(P＜0.01)。加入不同濃度的苦參堿后，MTT-OD值顯著低于醛固酮組，且呈劑量依賴性，與醛固酮組比較差異有顯著性意義(P＜0.05)。

2.3 FCM分析心肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期改變

苦參堿對細(xì)胞周期的影響見表1和圖2。加入醛固酮后，G0/G1期細(xì)胞百分比下降，S期、G2/M期細(xì)胞百分比升高(P＜0.05)，提示醛固酮促進(jìn)了細(xì)胞由G0期向S期的轉(zhuǎn)化。與醛固酮組比較，加入苦參堿后，G0/G1期細(xì)胞百分比升高，S期、G2/M期細(xì)胞百分比下降(P＜0.01)，表明細(xì)胞由G0期向S期的轉(zhuǎn)化受到抑制。

2.4 苦參堿對心肌成纖維細(xì)胞羥脯氨酸含量的影響

羥脯氨酸含量可表示膠原合成情況，通過測定，羥脯氨酸含量A組為0.0445±0.0025，B組為0.0635±0.0045，C組為0.0385±0.0045，D 組為 0.0375±0.0005，E 組為 0.0225±0.0105?？梢?，醛固酮組細(xì)胞上清液中的羥脯氨酸含量明顯高于對照組(P＜0.05)，表明醛固酮可顯著提高心肌成纖維細(xì)胞的膠原分泌總量。與醛固酮組比較，苦參堿組細(xì)胞上清液中的羥脯氨酸含量都明顯減少(P＜0.01)，并隨著濃度的增高，羥脯氨酸含量減少更明顯，呈劑量依賴效應(yīng)。

表1 各組心肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期分布(%)

圖2 FCM分析各組心肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期改變

圖3 細(xì)胞免疫熒光染色法檢測TGF-β1蛋白表達(dá)(×400)

2.5 TGF－β1表達(dá)情況

采用細(xì)胞免疫熒光染色法，TGF-β1蛋白陽性信號染色呈綠色熒光，位于胞漿(圖3)。醛固酮組的TGF-β1蛋白表達(dá)較對照組顯著增加(P＜0.01)，且表達(dá)量隨苦參堿劑量的增大而降低。流式細(xì)胞儀雙標(biāo)法的測定結(jié)果與細(xì)胞免疫熒光染色法一致(表2)。

表2 苦參堿對心肌成纖維細(xì)胞TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

苦參為豆科槐屬植物，主要成分為苦參堿、氧化苦參堿等多種生物堿類，以及苦參醇、苦參丁醇等多種黃酮類。苦參中的生物堿成分能夠抑制和逆轉(zhuǎn)早期肝纖維化病變，并已取得了確切的臨床療效?？鄥A可拮抗血小板衍生生長因子和血管緊張素Ⅱ的作用而抑制心肌成纖維細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、血管平滑肌增殖[2-3]，還可通過調(diào)節(jié)多種與增殖、周期和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來抑制腫瘤細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)分化與凋亡[4-6]。

本課題組既往的體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿能劑量依賴性地抑制壓力負(fù)荷因子血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的離體心肌成纖維細(xì)胞的增殖，且與周期蛋白P27蛋白表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)[7]。這提示苦參堿能抑制心肌間質(zhì)纖維化，具有一定的抗心室重構(gòu)作用。此外，高紅宇等[8]發(fā)現(xiàn)，苦參素可下調(diào)TGF-β1和Ⅰ型膠原的表達(dá)，抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及肌成纖維細(xì)胞的活化與增殖，作用途徑可能是通過下調(diào)Smad3的表達(dá)，干預(yù)Smad3介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終減輕腎間質(zhì)纖維化。但苦參堿對容量負(fù)荷醛固酮誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖及膠原代謝影響如何，TGF-β1在其中的作用還未見報道。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)醛固酮誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成，苦參堿進(jìn)行干預(yù)后，MTT-OD值、S期細(xì)胞百分比、羥脯氨酸含量均顯著低于醛固酮組(P＜0.01)。表明苦參堿具有很強(qiáng)的抑制容量負(fù)荷醛固酮誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成作用，并與濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系，即具良好的抗心肌纖維化作用。

心臟中的TGF-β1主要由心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)多種基質(zhì)成分合成，是多種生長因子誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞及心肌成纖維細(xì)胞增殖的信號通路中的一個重要環(huán)節(jié)。TGF-β1作為成纖維細(xì)胞的強(qiáng)趨化因子，還可直接刺激其細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成，促進(jìn)心肌纖維化過程[9]。TGF-β1介導(dǎo)的信號通路主要有TGF-β1/Smad信號通路和非Smad信號通路。非Smad信號通路可活化Erk、JNK MAPK及RhoA，而TGF-β1/Smad信號通路是TGF-β促細(xì)胞增殖或分化的主要通路。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，苦參堿的抗纖維化作用可能與其下調(diào)TGF-β1蛋白表達(dá)有關(guān)。但具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。

[1]陸小龍，趙連友，鄭強(qiáng)蓀，等.拉西地平對AVP誘導(dǎo)的大鼠心臟成纖維細(xì)胞增殖的影響及其與ERK1/2的關(guān)系[J].心臟雜志，2008，20(2):32.

[2]伍嚴(yán)安，高春芳.苦參堿抑制血小板衍生生長因子誘導(dǎo)的小鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2000，21(8):724-726.

[3]何立人.苦參堿對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌增殖及超微結(jié)構(gòu)的影響[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，1999，13(4):47.

[4]黃 建，陳康杰，張 臥，等.苦參堿抑制人大腸癌HT29細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡作用與機(jī)制[J].中草藥，2007，38(8):1 210.

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[6]陸麗華，冉志華.氧化苦參堿對人結(jié)腸癌細(xì)胞P21、P27、Cyclin E1及CDK2表達(dá)的影響[J].世界華人消化雜志，2007，15(12):1 353-1 357.

[7]周艷芳，黃培春，鮑 波，等.血管緊張素Ⅱ?qū)π募〕衫w維細(xì)胞增殖及p21，p27表達(dá)的影響[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2005，21(11):1 129.

[8]高紅宇，何曉峰，邵菊芳，等.苦參素對腎間質(zhì)纖維化大鼠腎小管上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，27(6):535.

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