代春華，馬海樂，趙圣惠，顧小紅，湯 堅，*

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與安全教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

黃粉蟲幼蟲降血壓肽酶解液脫色工藝的優(yōu)化

代春華1，2，馬海樂1，趙圣惠1，顧小紅2，湯 堅2，*

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與安全教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

采用粉末活性炭對脫脂黃粉蟲幼蟲降血壓肽酶解液進行脫色處理。通過單因素和正交實驗，考察了活性炭用量、pH、溫度和吸附時間等因素對脫色率（DE）、肽損失率（LP）和溶液對血管緊張素酶（ACE）的活性抑制率（IP）的影響。結(jié)果表明，粉末活性炭用量3%，pH3，脫色溫度40℃，吸附時間50min的條件下，黃粉蟲幼蟲降血壓肽酶解液脫色效果明顯，脫色率為85.3%，ACE抑制活性為70.8%。

黃粉蟲幼蟲，降血壓肽，酶解液，脫色

黃粉蟲學(xué)名：Tenebrio molitor Linne，別名大黃粉蟲、黃粉甲，俗稱面包蟲，是一種大型的倉儲害蟲。黃粉蟲幼蟲中脂肪、蛋白質(zhì)含量高，素有“動物蛋白飼料之王”的稱譽。長期以來，由于對其缺乏系統(tǒng)的研究，因此開發(fā)利用較少，使大量的營養(yǎng)資源被浪費［1-3］。為更好地開發(fā)利用此資源，作者以脫脂黃粉蟲幼蟲為原料進行酶解制備降血壓肽，實驗結(jié)果表明酶解液具有較好的降血壓效果，但黃粉蟲幼蟲在酶解過程中會伴隨大量色素物質(zhì)生成，導(dǎo)致酶解液為棕黃色，影響后續(xù)的分離純化效果。因此，本研究采用生產(chǎn)中常用的粉末活性炭進行脫色處理。以脫脂黃粉蟲幼蟲酶解液為原料，以脫色率（DE）和肽損失率（LP）為指標，采用單因素實驗對粉末活性炭脫色工藝條件進行比較，在肽損失率達到要求的基礎(chǔ)上，再以脫色率和酶解液對血管緊張素酶（ACE）的活性抑制率（IP）為指標，通過正交實驗考察各因素對指標的影響，確定黃粉蟲幼蟲酶解液脫色的最優(yōu)工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃粉蟲幼蟲粉 由鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)恒哲生態(tài)養(yǎng)殖場提供，均為干燥并粉碎的樣品，水分10%，油脂30.8%，蛋白質(zhì) 42.6%［4］；Alcalase蛋白酶 丹麥NovoNordisk公司提供；FAPGG、羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES） Sigma公司；其他化學(xué)試劑 上海國藥集團。

756 MC型紫外可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；TGL-16高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀儀器有限公司；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；pHS-3TC數(shù)顯pH計 上海天達儀器有限公司；電子天平 北京賽多利斯系統(tǒng)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃粉蟲幼蟲降血壓肽酶解液的制備 稱取5g黃粉蟲幼蟲粉裝入濾紙筒中，于索氏抽提器中以無水乙醚為提取劑回流提取4h，水浴溫度55℃。脫脂樣品于干燥箱中65℃干燥至恒重。

稱取3g脫脂黃粉蟲幼蟲粉，加入70mL蒸餾水，置50℃水浴中，加入40μL堿性蛋白酶（酶活力為34萬個單位），酶解1.5h，置沸水浴中15min使酶失活。離心、過濾、定容至100mL備用。

1.2.2 活性炭吸附脫色實驗 向脫脂黃粉蟲幼蟲酶解液中加入一定量的吸附劑，在一定的溫度、pH條件下吸附一定時間，高速離心后過濾得上清液，測其脫色率、肽損失率及溶液對ACE抑制活性。

1.2.3 脫色率和肽損失率測定 用紫外分光光度計在色素的最大吸收波長處（400nm）和蛋白質(zhì)的最大吸收波長處（280nm）分別測定溶液的吸光值，計算溶液脫色率（DE）和肽損失率（LP）［5-6］。

DE=（OD400-OD′400）/OD400×100%

其中：OD400為脫色前光吸收度；OD′400為脫色后光吸收度。

LP=（OD280-OD′280）/OD280×100%

其中：OD280為脫色前光吸收度；OD′280為脫色后光吸收度。

1.2.4 ACE抑制活性（IP）的測定 將樣品溶液稀釋20倍后，以FAPGG（FA-Phe-Gly-Gly）作為ACE的底物，測定各組分的ACE抑制活性［7］。測定在酶標儀中進行，按表1所示進行測定。

表1 ACE抑制活性的測定

加樣完成后立即在340nm測定對照孔和樣品孔的初始吸光度，分別設(shè)為a1和b1，在37℃的環(huán)境中避光放置30min后再次測定在340nm的吸光度，分別設(shè)為a2和b2。對照孔的吸光度減少A=（a1-a2），樣品孔的吸光度減少B=（b1-b2），抑制率（%）=（A-B）/A×100%

ACE酶活單位定義：在 37℃、1min內(nèi)催化FAPGG形成1μmol的FAP（FA-Phe）所需的酶量。

1.2.5 正交實驗 為獲得脫色效果較好的脫脂黃粉蟲幼蟲酶解液，在單因素實驗基礎(chǔ)上，通過L9（34）正交實驗確定最佳脫色條件，以脫色率及ACE抑制活性為指標，各因素和水平的選擇見表2。

表2 正交實驗因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 活性炭用量對脫色率和肽損失率的影響

將脫脂黃粉蟲幼蟲酶解液的pH調(diào)至4，分別加入不同量的活性炭，在40℃下脫色40min，不同活性炭用量對酶解液脫色率和肽損失率的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著活性炭用量的增加，脫色率提高，但肽損失率也隨之增加，綜合考慮在脫色效果已達到要求的范圍內(nèi)，應(yīng)以肽損失率最小為目標，因為隨著肽損失率的增加有可能使溶液中的活性成分也損失掉，故活性炭用量在3%較為適宜。

圖1 活性炭用量對脫色率和肽損失率的影響

2.2 pH對脫色率和肽損失率的影響

向酶解液中加入3%的活性炭，脫色溫度為40℃，分別在不同pH下脫色40min，pH對脫色率和肽損失率的影響結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，pH對脫色率及肽損失率的影響非常明顯，活性炭在pH小于4的酸性范圍內(nèi)脫色效果明顯好，但肽的損失率也較大。綜合考慮脫色率和肽損失率兩個方面的因素，應(yīng)該在脫色效果已達到要求的范圍內(nèi)，選擇肽損失率較低的pH，故確定溶液脫色pH為4。

圖2 pH對脫色率和肽損失率的影響

2.3 脫色溫度對脫色率和肽損失率的影響

將酶解液pH調(diào)至4，加入3%的活性炭，分別在不同的溫度下脫色40min，溫度對酶解液DE和LP影響結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，隨著溫度的升高，脫色率提高，同時肽損失率也增加，綜合考慮脫色效果和肽損失率兩個因素，選擇脫色溫度50℃。

圖3 溫度對脫色率和肽損失率的影響

2.4 吸附時間對脫色率和肽損失率的影響

將酶解液pH調(diào)至4，加入3%的活性炭，于50℃分別脫色20、40、60、80、100min，酶解液脫色率和肽損失率的變化結(jié)果如圖4所示。從圖4可知看出，脫色時間為40min時，活性炭對酶解液的脫色率最高，隨后逐漸降低；肽損失率也在脫色時間為40min時達到最大值，隨著脫色時間增加，肽損失率也在不斷地下降。在肽損失率較低的情況下，選擇脫色效果較好的時間條件，因此，脫色時間以40min為宜。

圖4 吸附時間對脫色率和肽損失率的影響

2.5 正交實驗結(jié)果分析

由于上述單因素實驗中未曾考慮因素之間的交互影響，因此，在以上實驗基礎(chǔ)上對上述四個因素進行正交實驗，由于脫脂黃粉蟲幼蟲酶解液中所含的活性肽有可能被活性炭吸附，在上述單因素實驗中用肽損失率還不能很好地反映出溶液中活性部分的保留情況。因此，正交實驗則改用酶解液的脫色率和ACE的抑制活性為考察指標，以確定最佳脫色條件，正交實驗結(jié)果如表3所示。

表3 正交實驗設(shè)計及結(jié)果

由表3可以看出，四個影響因素對脫色率和對ACE抑制活性的影響是不同的，活性炭在酶解液脫色的過程中，要求脫色率和溶液活性最大，本研究采用加權(quán)評分法，確定兩者的權(quán)重系數(shù)均為0.5后對兩項指標進行加權(quán)求和得到綜合評分如表4［6］。

表4 加權(quán)綜合評分結(jié)果

從加權(quán)綜合評分結(jié)果看出，溶液的pH對脫色率及ACE抑制活性的影響最為明顯，其次是活性炭用量，脫色溫度對指標的影響最小，最佳脫色條件為：A2B1C1D2，在此條件下進行脫色實驗，測得脫色率為85.3%，ACE抑制活性為70.8%。

3 結(jié)論

脫脂黃粉蟲幼蟲酶解液顏色較深，對其進一步分離純化產(chǎn)生不良影響，因此必須對酶解液進行脫色。以脫色率及肽損失率為指標，通過單因素實驗篩選出活性炭對酶解液脫色的較佳條件。再以脫色率和對ACE抑制活性為指標進行正交實驗，得出脫色最佳條件為：粉末活性炭用量3%，pH3，脫色溫度40℃，吸附時間50min。在此實驗條件下，測得酶解液的脫色率為85.3%，ACE抑制活性為70.8%。黃粉蟲幼蟲降血壓肽酶解液為透明淺黃色，可直接進行后續(xù)分離純化工作。

［1］王文亮，孫守義，王守經(jīng)，等.中國黃粉蟲食品研究開發(fā)現(xiàn)狀及發(fā)展前景［J］.世界農(nóng)業(yè)，2007（9）：50-52.

［2］趙大軍.黃粉蟲的營養(yǎng)成分及食用價值［J］.糧油食品科技，2000，8（2）：41-42.

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［4］代春華，馬海樂，顧小紅，等.黃粉蟲幼蟲及蛹中營養(yǎng)成分分析［J］.食品工業(yè)科技，2009（4）：315-317.

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Optimization of decolouring technology of antihypertensive peptides hydrolysate from defatted larva of Tenebrio molitor（L.）

DAI Chun-hua1，2，MA Hai-le1，ZHAO Sheng-hui1，GU Xiao-hong2，TANG Jian2，*
（1.School of Food and Biology Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Single factor and orthogonal experiments were applied to investigate the optimum conditions of decolouring of defatted larva of Tenebrio molito（rL.）hydrolysate.ln the experiments，the factors of activated carbon quantity，pH，temperature and absorption time were considered in terms of decolouring efficiency，peptide loss and inhibition percentage of angiotensin converting enzyme（ACE）activity.The results showed that optimum decoloration effect was obtained from the following conditions：quantity of activated carbon 3%，pH value 3，temperature 40℃，and adsorption time 50min，respectively.Then decolouring efficiency and inhibition percentage of ACE were 85.3%and 70.8%，respectively.

larva of Tenebrio molito（rL.）；antihypertensive peptides；hydrolysate；decolorization

TS201.1

B

1002-0306（2010）12-0261-03

2009-12-28 *通訊聯(lián)系人

代春華（1972-），女，講師，在讀博士，主要從事食品功能性因子的檢測。

鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科技項目（NY2008028）。