張啟云，李冰濤，徐國良，孫立波，湯喜蘭，黃麗萍，余日躍，劉紅寧

(1.江西中醫(yī)學院現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，江西南昌 330006;2.江西中醫(yī)學院藥學院，江西南昌 330006)

代謝組學(metabonomics)是后基因時代出現(xiàn)的一門新的組學學科，主要是通過核磁共振，質譜聯(lián)用定量檢測生物液如尿液，血液和膽汁等中相對分子質量小于1000的內源性物質，結合化學計量學的方法對獲取的多維數(shù)據(jù)進行處理和分析，提取有用的數(shù)據(jù)信息，判定生物標志物，再通過進一步研究解釋藥物作用的機制［1］。代謝組學研究思路上的整體性和動態(tài)性，與中醫(yī)藥理論的整體觀念是相一致的［2］，因此，將代謝組學的方法應用到中醫(yī)藥研究中，有助于從整體上完整地了解中醫(yī)藥的作用機制。

干姜是一種基本的熱性中藥，目前尚未有文獻記載干姜對正常大鼠尿樣中內源性代謝產(chǎn)物的影響。本文利用液相色譜-質譜聯(lián)用的檢測平臺開展對中藥材干姜水提物對SD大鼠尿液的代謝組學研究，并利用主成分分析(principal component analysis，PCA)，正交信號校正和偏最小二乘法判別分析(orthogonal signal correction-partial least square discriminate analysis，OSC-PLS-DA)化學計量學方法分析干姜的代謝組學特征，以期發(fā)現(xiàn)可作為生物標志物的內源性物質。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器

SD大鼠，雄性，體重220～240 g，江西中醫(yī)學院動物中心提供，許可證號:SCXK(贛)2006-0001，大鼠自由攝食飲水，溫度:21～25℃，日照時間12 h。干姜，產(chǎn)地四川犍為，家種統(tǒng)裝，產(chǎn)品批號:20061003。干姜水提液提取的具體方法:400 g干姜切片，加10倍量水浸泡1 h，微沸回流提取1.5 h，過濾收集提取液;再相當于原藥材重量的8倍量水提取1 h，合并2次水提液，旋轉蒸發(fā)濃縮干姜水提液至6 kg·L－1(每升水提液相當于6 kg干姜生藥材)。SIGMA3-18K低溫高速離心機(Sartorius公司，德國)，Agilent1200 6410三重四極桿質譜儀(Agilent公司，美國)，電子分析天平(Sartorius公司，德國)，甲酸(Fluka公司，美國)，乙腈(Tedia公司，美國)，水為去離子水，數(shù)據(jù)處理軟件為SIMCA-P11.0(Umetrics AB公司，瑞典)，SQL Server(Microsoft公司，美國)，SPSS13.0(SPSS公司，美國)。

1.2 動物分組處理

20只大鼠隨機分為正常對照組和干姜組，每組10只，干姜組大鼠每天14:00 ig給予干姜生藥0.72g·kg－1，每天 1 次，連續(xù) 30 d，正常對照組按 10 ml·kg－1給予蒸餾水。

1.3 尿液收集及樣品制備

正常對照組和干姜組大鼠分別于第0，1，8，15，22，29天收集14:00給藥后3 h內尿液，－20℃保存。低溫解凍，4℃下15 493×g，離心5 min，取上清液0.5 ml加入甲醇 0.5 ml，混勻，在 4℃下靜置3 h，29 703 ×g離心10 min，取上清液，進樣。

1.4 高效液相色譜-質譜-質譜法測定尿液中內源性物質

1.4.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Zorbax Eclipse SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相:乙腈(A)、0.1%甲酸(B)流速:0.4 ml·min－1，進樣量:3 μl，柱溫:35℃，運行20 min。梯度洗脫條件如下:0～6 min(B:100%)，6～ 8 min(B:30%)，12～14 min(B:10%)，14.1～15 min(B:10%)，后運行5 min。

1.4.2 質譜條件

離子源模式:ESI正離子模式;毛細管電壓:4000V;霧化器壓力:275.8 kPa;干燥氣流速:10 L·min－1，干燥氣溫度:350℃，全掃描監(jiān)測得尿液總離子流色譜圖(total ion chromatogram，TIC)，提取質譜信息，得到尿液樣品所含物質的質荷比(mass-tocharge，m/z)。

1.5 數(shù)據(jù)集及生物標志物判定

使用SIMCA-P 12.0自帶程序進行正交信號校正(OSC)，正交信號校正過程中，類別變量為Y變量。數(shù)據(jù)經(jīng)Pareto標準化后，進行OSC-PLS-DA分析［3］。對OSC-PLS-DA模型中變量重要程度(variable importance，VIP)＞3的變量進行獨立樣本t檢驗，VIP是反映變量對模型重要性的系數(shù)，VIP值越大，變量對模型越重要。生物標志物是能夠代表外來刺激和內源性生理改變的內源性物質，反映在OSC-PLS-DA模型上即是具有顯著差異的重要變量。在95%的置信度下變量內正常對照組與干姜組數(shù)據(jù)具有顯著差異的變量為生物標志物［4］。

1.6 統(tǒng)計學分析

應用SIMCA-P 12.0多變量分析軟件進行統(tǒng)計學分析。組間比較采樣用獨立t檢驗，兩兩比較采用SPSS13.0軟件和Hotelling T2檢驗。

2 結果

2.1 干姜對大鼠尿液中內源性物質代謝影響的時間軌跡分析

將液相色譜-質譜法掃描得大鼠尿液TIC(圖1)中獲取的正常對照組和干姜組大鼠尿液樣品所含物質的豐度信息將數(shù)據(jù)轉化Excel數(shù)據(jù)表。對給藥后第0，1，8，15，22和29天正常對照組和干姜組大鼠尿液中內源性物質的豐度值均值做PCA分析。通過均值樣本點距離，以分析干姜對內源性物質代謝影響的時間軌跡，進而比較各采樣時間點干姜對大鼠尿樣內源性物質的影響。時間軌跡分析過程，數(shù)據(jù)標準化使用Pareto，結果如圖2。

圖2結果表明隨著給藥時間的不同，正常對照組和干姜組各時間點的得分值都發(fā)生了變化，說明時間因素可能對大鼠內源性物質有影響;其次，比較各時間點的正常對照組與干姜組的差異，給藥第8天正常對照組與干姜組尿樣均值樣本點間距離較其余時間點中兩組樣本點間距離大，表明第8天干姜對大鼠內源性物質代謝的影響比其他時間點大，因此，使用第8天數(shù)據(jù)分析干姜對大鼠尿樣代謝產(chǎn)物的影響。

圖1 液相色譜-質譜法大鼠尿液的總離子流色譜圖.Fig.1 The total ion chromatogram of the rats.

圖2 時間對大鼠ig給予干姜后尿液中內源性物質的影響的主成分分析圖.干姜組大鼠每天14:00 ig給予干姜0.72 g·kg－1，正常對照組大鼠給予蒸餾水，連續(xù)30 d，收集給藥3 h后尿樣，液相色譜-質譜法采集尿樣中內源性物質的質荷比和豐度值，數(shù)據(jù)匹配后，對采樣時間點按組別分類的均值作主成分分析，主成分的分散點圖反映原始數(shù)據(jù)整體分布特征，以觀察干姜對內源性物質代謝影響的時間軌跡.△:正常對照組;▲:干姜組，0，1，8，15，22，29表示尿樣取樣時間點.Fig.2 Principal component analysis(PCA)of data about effect of time on endogenous metabolites after rats were ig given Rhizoma Zingiberis.

2.2 給藥第8天干姜對大鼠尿液內源性物質影響的主成分分析

對給藥第8天正常對照組與干姜組尿樣中內源性物質豐度值主成分分析，得分圖見圖3，正常對照組與干姜組樣本點各自具有良好的聚類特征，兩組之間沒有樣本點重合，說明在給藥第8天干姜對大鼠尿液中內源性物質的代謝的影響。

圖3 干姜對大鼠ig給予干姜第8天尿液內源性物質影響的主成分得分圖.動物分組給藥見圖2.△:正常對照組;▲:干姜組.Fig.3 PCA score plot of data about effect of Rhizoma Zingiberis on endogenous metabolites after rats were ig given Rhizoma Zingiberis at d 8.

2.3 給藥第8天干姜對大鼠尿液內源性物質影響的OSC-PLS-DA分析

除干姜因素外，大鼠的個體差異，飲食，晝夜變化等都會影響大鼠尿樣中內源性物質的代謝，將嚴重影響分析結果的正確性。正交信號校正(OSC)是一種基于偏最小二乘法的濾噪方法，能夠消除與Y(分類變量)變量正交成分(飲食等外界因素的數(shù)據(jù)信息)，保留有效的數(shù)據(jù)信息，提高模型的有效性和解釋能力。

使用SIMCA-P 11.0自帶的程序所得正交信號對本實驗進行校正，校正過程中以組別變量為Y變量，刪除前兩個與Y變量正交成分。正交信號校正前刪除差異樣本點8rz3。正交信號校正后建OSCPLS-DA 模型。模型的 R2X=0.721，R2Y=0.999，Q2=0.971，即擬合后的模型能解釋72.1%X變量，99.9%Y變量。Q2=0.971，表明經(jīng)7倍交叉有效性檢驗模型有效。圖4和圖5分別為OSC-PLS-DA模型的得分圖及相應的載荷圖。與圖3相比較，圖4中正常對照組與干姜組樣本有更好的分離趨勢，且組內差異變小，表明OSC-PLS-DA比PCA具有更好的分類能力。正常對照組和干姜組樣本點在得分圖中沿第一主成分分開。第一主成分主要包含干姜水提液對大鼠尿樣代謝產(chǎn)物影響的數(shù)據(jù)信息，因此應提取第一主成分VIP變量。圖5顯示多數(shù)變量在原點附近，少數(shù)變量偏離原點，對模型有重要影響，所代表的物質為可能的生物標志物。

圖4 干姜對大鼠ig給予干姜后第8天尿液內源性物質影響的OSC-PLS-DA分析得分圖.動物分組給藥見圖2.△正常對照組;▲干姜組.Fig.4 OSC-PLS-DA score plot about effect of Rhizoma Zingiberis on endogenous metabolites after rats were ig given Rhizome Zingiberis at d 8.

圖5 干姜對大鼠ig給予干姜第8天尿液內源性物質影響的OSC-PLS-DA分析的載荷圖.動物分組給藥見圖2.▲:以質荷比命名的變量，□內為可能生物標志物變量.Fig.5 Loading plots of OSC-PLS-DA about effect of Rhizoma Zingiberis on endogenous metabolites after rats were ig given Rhizoma Zingiberis at d 8.

2.4 可能受干姜影響的大鼠尿液內生物標志物

采用液相色譜-質譜聯(lián)用篩查內源性物質信息，依據(jù)內源性物質數(shù)據(jù)對OSC-PLS-DA模型的影響和生物標志物的統(tǒng)計學特征篩查生物標志物。由于干姜具有成分復雜、藥理作用廣泛的特點，提取一種物質來表示干姜對大鼠內源性物質的影響，難以全面描述干姜對大鼠內源性物質的影響作用。因此將VIP值大于3.0，獨立樣本T檢驗(95%)正常對照組和干姜組數(shù)據(jù)具有顯著性差異的變量定義為生物標志物變量。通過查找相關網(wǎng)站HMDB/KEGG/METLIN，初步確定可能生物標志物如表1。

表1 干姜影響大鼠尿液內源性物質的可能生物標志物Tab.1 Possible biomarkers in endogenous metabolites affected by Rhizoma Zingiberis after Rhizoma Zingiberis was ig given in rats for 30 d

3 討論

干姜為姜科植物姜(Zingiber officinale Rosc.)的干燥根莖，又名白姜、均姜。中醫(yī)的理論認為干姜為熱性中藥，具有溫中散寒、回陽救逆、燥濕消痰的功用［5］。臨床用來治療腸炎，腹瀉，嘔吐，冠心病，心肌梗死等疾病?，F(xiàn)代藥理研究表明，干姜具有鎮(zhèn)痛抗炎，保肝利膽，抗?jié)?，改善心血管系統(tǒng)等藥理活性［6］。本研究結合代謝組學的方法，研究了干姜水提物的灌胃大鼠尿液代謝組特征，初步篩選10種生物標志物來標記干姜水提物對大鼠內源性物質的影響。其中，磷脂酸具有刺激血小板聚集，平滑肌收縮，體內血管活性等生物活性。孕烯醇酮硫酸鹽屬腎上腺皮質激素類物質。這兩種物質的變化與熱性中藥在心血管中的藥理作用和溫熱中藥對內分泌系統(tǒng)的影響具有一定的相關性［7－8］。神經(jīng)酰胺-1-磷酸能夠通過易位和激活細胞質磷脂酶A2而誘導花生四烯酸和前列腺素的合成［9］?；ㄉ南┧岷颓傲邢偎厥茄装Y的主要介質，文獻報道干姜是通過降低細胞質磷脂酶A2的活性而發(fā)揮抗炎作用的［15］。因此，可以推斷干姜抗炎作用的傳導細胞信號可能是神經(jīng)酰胺-1-磷酸。

本研究結果表明，干姜在大鼠尿液中生物標志物的變化與干姜藥理、藥性的研究成果一致，為熱性中藥藥性理論研究提供了實驗依據(jù)。

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