薛建躍

（巢湖學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)系，安徽 巢湖 238000）

酶固定化及應(yīng)用研究進展

薛建躍

（巢湖學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)系，安徽 巢湖 238000）

本文主要從酶生物催化劑固定化載體、固定化方法等方面介紹了固定化酶的研究進展情況，并從其在醫(yī)藥、食品、環(huán)保、能源等方面的新應(yīng)用出發(fā)，綜述了固定化酶在新領(lǐng)域中的應(yīng)用，展望了酶固定化研究的發(fā)展前景，指出了今后酶固定化研究的主要方向是多酶固定化及制備高活性、高負載、高穩(wěn)定性的固定化酶。

酶固定化；微波輔助固定化；交聯(lián)酶聚集體；仿生固定化

傳統(tǒng)的酶固定化技術(shù)雖在一定程度上可以增強生物催化劑的穩(wěn)定性，但增強幅度有待進一步提高，并且傳統(tǒng)固定化過程中，生物催化劑酶催化活力通常損失嚴重，如何通過固定化獲得合適的生物催化劑一直為化學(xué)家和生物學(xué)家所關(guān)注。[1-3]

在酶生物催化劑的固定化研究中，目前不斷地有新的載體和技術(shù)引入，[4]如：無載體固定化、微波輔助的固定化、陽光照射輔助固定化等等，且固定化生物催化劑的應(yīng)用也越來越廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)藥、環(huán)境保護、化學(xué)工業(yè)、食品工業(yè)、醫(yī)療領(lǐng)域等，本文將從酶生物催化劑固定化載體、固定化方法和技術(shù)及固定化酶的應(yīng)用等幾個方面出發(fā)，歸納和綜述這些方面近年來的研究進展。

1 酶固定化過程中的新載體

1.1 介孔材料

自從1992年美國Mobile公司首次合成出了MCM-41系列介孔分子篩以來，[5]介孔材料在酶生物催化劑固定化方面的研究和應(yīng)用日益受到人們的重視，[6]孔道的結(jié)構(gòu)和尺寸對酶活力及穩(wěn)定性有著明顯的影響，[7-8]合適的孔道中酶固定化后其活力提高到游離酶的2倍，[9]且三維及大孔道有利于固定化與催化過程中酶蛋白和底物、產(chǎn)物的傳輸，從而能提高酶的固定化和催化效果。[10-11]

目前，大孔道、高比表面和孔容的新型介孔材料不斷被引入酶固定化領(lǐng)域，[12-13]因為大孔道、高比表面、高孔容的介孔材料中酶的負載量大（圖1），且酶的負載能快速完成，[14]負載量高達580mg/g。[15]王安明等人[11]通過運用微波輻射加快物質(zhì)傳輸原理，將微波技術(shù)引入酶在介孔中的固定化過程，利用微波輻射進一步促進酶蛋白在孔道中傳輸，在介孔泡沫硅 （Mesocellular Silica Foams，MCFs）固定化木瓜蛋白酶的過程中，使得酶負載量達到984.1mg/g。該高負載的固定化酶的制備將有利于其在在工業(yè)中的推廣和應(yīng)用，高負載的固定化酶一方面能有利于提高生產(chǎn)效率及時間、空間的利用率，另一方面通過補充高負載量的固定化酶，無須延長批次反應(yīng)的時間。[16]

圖1 棒狀SBA-15相對于傳統(tǒng)SBA-15的超強酶固定化能力

1.2 納米管

Tsang[17]等人利用高分辨率電子投射顯微鏡（HRTEM）清晰地觀察到碳納米管道中的酶蛋白，通過活力研究表明管道中的酶蛋白活性未見明顯變化。Davis等人[18]將青霉素?；腹潭ɑ焦潭ɑ谔技{米管中，發(fā)現(xiàn)納米管的內(nèi)表面與酶蛋白之間存在著強烈的作用，從而使得管內(nèi)酶蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且保留相當?shù)拇呋盍?。Jung等人[19]先是將多壁碳納米管羧基功能化，再將葡萄糖氧化酶共價固定化于管道表面制成了石墨電極，循環(huán)伏安研究表明此電極能有效實現(xiàn)葡萄糖的氧化及電子的傳遞，從而可應(yīng)用于酶生物燃料電池中。近年來，硅納米管也不斷地作為載體被引入酶固定化過程。肖清桂[20]等人利用針狀Ca-CO3作模板，成功制備了硅納米管，并將青霉素酰化酶固定化于其中，發(fā)現(xiàn)酶的相對活力達到97.2%，表明酶固定化于管道中后，催化活力基本未見下降，同時，酶的熱穩(wěn)定性、pH耐受性等性能也明顯改善。

1.3 磁性載體

由于磁性粒子易于分離，其作為酶固定化載體一直受到人們的青睞。Dyal等[21]先是將磁性Fe2O3表面功能化，再將酶共價固定化于其表面，制得了磁性固定化酶，該固定化酶穩(wěn)定性極佳，14天后其催化活力下降不到2%。Yu等人[22]等將胞苷酸合成酶定向共價固定化于磁性納米粒子表面，并得到了高穩(wěn)定的固定化酶，該法在操作過程中省去了冗長的蛋白質(zhì)純化過程。雷重禮等[23]通過PEI包埋修飾磁性顆粒，再將膠原酶共價固定化于其表面，發(fā)現(xiàn)隨著磁性載體表面PEI層數(shù)的遞增，固定化酶的穩(wěn)定性越來越好。Kim等人[24]將酶蛋白與磁性納米粒子共同組裝進介孔材料的孔道中，再通過戊二醛將酶蛋白交聯(lián)制得磁性介孔材料內(nèi)的交聯(lián)酶聚集體（Magnetite Crosslinked Enzyme Aggregates，M-CLEAs），該固定化催化劑在催化過程中表現(xiàn)出極佳的穩(wěn)定性，且因具有磁性而能方便地實現(xiàn)固液分離。

1.4 尼龍材料及棉布

Teke等[25]精巧地將尼龍布載體引入酶的固定化過程中，首先是在紫外輻射下借助苯甲酮引發(fā)尼龍纖維膜的活化，再通過甲基丙烯酸縮水甘油酯接枝，實現(xiàn)纖維膜的功能化，最后將脲酶共價連接于其表面，從而在催化過程中能很方便地實現(xiàn)固定化酶與產(chǎn)物的分離。

Isgrove等[26]利用戊二醛活化尼龍薄膜，然后再將酶共價固定化到膜表面，通過NaBH4處理不飽和的C=N雙鍵，以進一步穩(wěn)定連接到膜表面的酶，同時運用不同的連接臂，發(fā)現(xiàn)PEI最適于穩(wěn)定酶蛋白。Ibrahim[27]等將淀粉酶、漆酶等固定到酯交聯(lián)和Cu2+鰲合的棉布表面，并充分地研究了該固定化酶的抗菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)棉布表面的酶保持了較好的穩(wěn)定性，使用10個批次后，抗菌活性未見下降。李鳳艷[28]等首先制備了溶膠凝膠，再將棉布和木瓜蛋白酶沉浸于其中，通過凝膠化，使酶固定化于面部表面，成功地實現(xiàn)了酶的固定化，經(jīng)過6個批次的使用后固定酶的活力就下降到初始狀態(tài)的30%，工業(yè)中應(yīng)用時該類固定化酶的穩(wěn)定性還有待于進一步提高。

1.5 離子液體

Rumbau等人[29]將山葵過氧化物酶固定化于離子液體 （butyl-3-methylimidazolium bistrifluoromethanesulfonimide，1-丁基-3-甲基-咪唑-六氟二甲磺酸銨鹽）中，在加入到反應(yīng)體系中，催化合成導(dǎo)電的聚胺高分子物質(zhì)，催化過程中離子液體既用作酶的擔(dān)體，也用作催化介質(zhì)，其與水相不能互溶而組成二相體系，酶很容易從反應(yīng)體系中分離（圖2）。Safavi等[30]將碳-離子液體復(fù)合電極沉浸與血紅蛋白的溶液中，通過吸附方式將血紅蛋白固定化于電極表面制得了酶電極，研究發(fā)現(xiàn)修飾電極的環(huán)狀電壓展現(xiàn)了半可逆的峰位，氧化和還原的峰位電勢分別達到-150mV和-290mV，電極表面的血紅蛋白對氧氣、雙氧水、亞硝酸鹽等顯示了很好的電催化活力。

圖2 離子液體固定化酶催化合成聚苯胺及分離

2 酶固定化的新技術(shù)、新方法

2.1 微波輔助固定化

王安明等人[31]首次將智能可控微波技術(shù)引入到酶固定化過程，常規(guī)方法中至少需要15個小時，微波輻射下只需要140秒，大大縮短了固定化時間，且微波輻射下青霉素酰化酶的活力是游離酶的1.45倍。王安明等[11]還將可控微波輻射技術(shù)引入低溫下介孔泡沫二氧化硅固定化木瓜蛋白酶的過程，發(fā)現(xiàn)微波輻射下載體的載酶量達到984.1mg/g，且酶負載量及固定化酶活力分別是常規(guī)方法的1.26倍和1.86倍，此固定化效果國內(nèi)外文獻中未見報道。

2.2 光化學(xué)固定化

Kumar和Nahar通過光照將山葵過氧化物酶和葡萄糖氧化酶成功地固定于纖維素膜表面，并研究了光照強度對酶固定化的影響，發(fā)現(xiàn)光照下酶的負載量是黑暗中的2.6倍，且發(fā)現(xiàn)日光照射下的固定化效果優(yōu)于紫外（365nm）輻射下的酶固定化，這為酶及其他生物分子的固定化提供了一條新的途徑，但是該固定化局限于天氣條件，工程中的應(yīng)用會受到很大限制。

2.3 納米技術(shù)輔助下的固定化

2.3.1 金屬納米粒子誘導(dǎo)下的固定化

在金屬納米粒子輔助固定化酶的研究中，印度學(xué)者Mukhopadhyay等[32]首先在Na-Y沸石表面沉積金納米粒子，并將該復(fù)合粒子作為載體固定化胃蛋白酶，發(fā)現(xiàn)金屬納米粒子大大增強了酶的催化活力，遺憾的是酶是吸附于載體表面，重復(fù)使用6個批次后，催化活力即下降到初始狀態(tài)的1/3。沈樹寶等人[33]曾采用“一步法”制備了功能化的SiO2納米粒子，并在其表面通過氧化還原的方法沉積了銀納米粒子，再將木瓜蛋白酶共價連接于載體表面，其中，當載體的銀負載量為0.68%時，酶活回收率最高，比未負載銀的載體提高了188%，且重復(fù)使用中固定化酶保持了較好的操作穩(wěn)定性，這可能是固定化和催化過程中銀納米粒子與酶蛋白或底物酪蛋白之間至少存在著三方面的作用：絡(luò)合作用、靜電作用、納米效應(yīng)。

2.3.2 單酶納米粒子

Kim和Grate首先通過丙烯酰氯分別將嗜熱蛋白酶與胰蛋白酶表面進行不飽和修飾，再通過與不飽和單體的共聚而制得蛋白酶納米粒子，固定化后酶的催化效率雖然下降了50%，但是酶的穩(wěn)定性得到了大幅提高。清華大學(xué)的閻明[34]等人采用類似的方法，制得了山葵過氧化物酶納米粒子（圖3），該單酶納米粒子在高極性的有機溶劑中仍能保持很強的熱穩(wěn)定性，而游離酶此時幾乎喪失了所有活性。

圖3 單酶納米溶膠的膠囊化

2.4 無載體固定化

2.4.1 交聯(lián)酶晶體（CLECs）

交聯(lián)酶晶體 （cross-linked enzyme crystals，CLECs）是指通過交聯(lián)劑，如：戊二醛，將在水溶液中的酶晶體交聯(lián)成一種穩(wěn)定結(jié)構(gòu)及性能的晶態(tài)物質(zhì)，其既具有酶的高活性、高選擇性、反應(yīng)條件溫和等特點，又具有固相催化劑的環(huán)境適應(yīng)性強、易回收等優(yōu)勢，從而使其在有機合成中應(yīng)有較廣。[35]1964年，Quiocho和Richards[36]最早制備了交聯(lián)酶晶體，當時是用來固定酶的構(gòu)象以方便進行X射線研究，其后的時間里對它的開發(fā)應(yīng)用并未引起人們足夠的重視。

2.4.2 交聯(lián)酶聚集體（CLEAs）

相對于CLECs，交聯(lián)酶聚集體（Cross-linked enzyme aggregates，CLEAs）的制備過程更加簡單，無需結(jié)晶，對酶的純度要求不如前者，制備過程簡化很多，其活性和穩(wěn)定性可與CLECs相媲美。在CLEAs制備中，濃縮的酶蛋白會發(fā)生物理聚集而形成超分子結(jié)構(gòu)，加入無機鹽、有機溶劑或其他大分子試劑可使其聚集體沉淀析出，能保持酶的三維構(gòu)象和活性，再用多功能交聯(lián)劑將該酶聚集體交聯(lián)捆綁形成CLEAs[37-38]（圖4）。van Pelt等[39]制備了氰水合酶的交聯(lián)酶聚集體，雖然聚集體的酶活性只有溶液酶的21%，貯存穩(wěn)定性及操作穩(wěn)定性顯著改善。Kaul等[40]運用睛水解酶制得了相應(yīng)的酶聚集體，活力回收達到80%，且該聚集體相對于游離酶表現(xiàn)出了較好的熱穩(wěn)定性及立體選擇性。如果該方法中能成功解決固定化酶的機械穩(wěn)定性及高活力回收等問題，該法必將成為酶工程領(lǐng)域中最成功的固定化技術(shù)。

圖4 有機溶劑中脂肪酶聚集體的簡易制備程序

2.5 點擊化學(xué)固定化

點擊化學(xué)（Click chemistry）的概念是由諾貝爾化學(xué)獎獲得者美國化學(xué)家Sharpless在2001年提出的一種快速合成大量化合物的新方法，[41]為繼組合化學(xué)之后又一給傳統(tǒng)有機合成化學(xué)帶來重大革新的合成技術(shù)，該技術(shù)目前也已被用于酶的固定化研究。Brennan等[42]首先對金納米粒子進行修飾，再通過點擊化學(xué)方法將酶共價連接于納米粒子表面，并通過電泳和熒光測試手段表征了該酶-納米粒子復(fù)合物，初步估計每個金納米粒子表面附著了7個脂肪酶分子。

3 固定化酶的新應(yīng)用

固定化酶的研究和應(yīng)用不僅在化學(xué)生物學(xué)、生物工程醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)等領(lǐng)域異常活躍，而且因為具有節(jié)省能源與資源、減少污染的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)而符合可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略要求，目前固定化酶已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域、食品行業(yè)、化工行業(yè)、材料科學(xué)、環(huán)保領(lǐng)域、能源領(lǐng)域、蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域。

3.1 醫(yī)藥領(lǐng)域

青霉素酰化酶，亦稱青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶，既可水解青霉素和擴環(huán)酸生成6-氨基青霉烷酸（6-APA）和7-氨基脫乙酰頭孢烷酸（7-ADCA），也能制備半合成抗生素類。

堿性條件下青霉素酰化酶催化水解可生成半合成β-內(nèi)酰胺類抗生素所需中間體6-APA（如圖4所示）、7-ADCA。酶法催化具有效率高、環(huán)保且易分離，可重復(fù)使用以降低成本的優(yōu)勢。用6-APA、7-ADCA等中間體，與新的D-氨基酸類在酸性條件下也可合成各種具有新的抗菌活性和抗菌譜的半合成抗生素。固定化酶的酶法合成具有反應(yīng)條件溫和、工藝操作簡單、無需基團保護等優(yōu)勢。目前報道過的酶法合成產(chǎn)品有阿莫西林[43]、頭孢氨芐[44-45]、氨芐西林[46]等。

3.2 食品行業(yè)

Othman等[47]分別將脂肪酶固定于商業(yè)載體Eupergit C和Eupergit C 250L上，并將制得的固定化酶應(yīng)用于合成薄荷醇丁酸酯，該化合物廣泛運用于食品行業(yè)。[48]Del Nobile等[49]將柚苷酶固定于聚乙二醇膜表面，制得食品級的生物活性膜，用于柚汁的包裝中以便在貯存過程中減少柚汁中柚苷的含量，從而大大提高柚汁的感官品質(zhì)。

3.3 化工行業(yè)

隨著綠色化學(xué)工業(yè)的不斷發(fā)展，固定化酶生物催化劑在化工行業(yè)中的應(yīng)用越來越深入，其主要作用是代替化學(xué)催化劑制備化工原料。Yu等人[50]將脂肪酶固定化于SBA-15介孔材料中，并利用該固定化酶拆分制備（S）-2-辛醇中，結(jié)果表明在優(yōu)化的條件下（S）-2-辛醇ee%超過99%，且轉(zhuǎn)化率超過52%，固定化酶重復(fù)使用5次后仍能保持90%的初始活力。

3.4 環(huán)境保護

Havens等[51]通過共聚方式將硝苯硫磷酯水解酶鑲嵌于聚氨酯泡沫中，將其成功應(yīng)用于有機磷農(nóng)藥的解毒和去除過程中。LeJeune等[52]運用類似的方法制得膦酸酯化酶泡沫酶，將此泡沫酶應(yīng)用于空氣凈化中降解空氣中的神經(jīng)毒氣，取得了一定的效果。張等人[53]將山葵過氧化物酶固定于聚丙烯酰胺凝膠中，再將制得的固定化酶填充于柱子中，用以去除水體中的五氯苯酚，1小時內(nèi)能將五氯苯酚濃度從13.4mg/L降到4.9mg/L，且柱中的固定化酶能重復(fù)使用。

3.5 能源領(lǐng)域

Sagiroglu[54]將豬胰脂肪酶和假絲酵母脂肪酶分別固定于水滑石表面，并將它們用于催化葵花子油轉(zhuǎn)脂化作用制得生物柴油，制得的蛇生物柴油燃燒后無SO2產(chǎn)生，且煙塵顆粒減小，研究還發(fā)現(xiàn)2種脂肪酶皆表現(xiàn)了很好的活力，同時轉(zhuǎn)脂化過程中正己烷等有機溶劑比較適合酶催化反應(yīng)。另外，如何提高電流密度一直是困擾酶生物燃料電池研究人員的難題，[55]而提高酶的負載量將是解決此問題的一條重要途徑，同時，利用納米結(jié)構(gòu)固定化酶從而制得酶電極以穩(wěn)定酶的催化性能也在酶生物燃料電池研究中扮演重要的角色。Fischback等[56]將葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOx）組裝進碳納米管（CNTs），并利用其構(gòu)建酶陽極，采用可折疊式質(zhì)子交換摸（PEM）燃料電池模式裝配了微型生物燃料電池（BFCs），大小為12×12×9 mm，該酶生物燃料電池能連續(xù)使用16小時以上。

4 結(jié)論與展望

（1）制備高活性、高負載、高穩(wěn)定的固定化酶是酶固定化研究的主要方向，因為這樣的固定化酶在應(yīng)用中能大大降低目標產(chǎn)物的制備成本，且在酶生物燃料電池中能大大提高電流密度，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中能節(jié)省時間，提高效率和準確度。

（2）隨著多酶催化的深入研究，多酶固定化技術(shù)的開發(fā)將成為酶固定化領(lǐng)域的重要內(nèi)容之一。

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PROGRESS IN THE IMMOBILIZATION AND APPLICATION OF ENZYME BIOCATALYST

XUE Jian-yue
（Department of Chemistry and Materials，University of Chaohu，Chaohu Anhui 238000）

This article reviewed the new progress of the immobilization of enzyme biocatalyst from immobilization support，immobilizing technique.The new application of the novel immobilized enzyme in the pharmaceutical engineering，food engineering，environment engineering，energy engineering and proteomics was also represented.Trend of enzyme biocatalyst immobilization was proposed to be multi-enzyme immobilization and immobilization of enzyme with high loading，high activity and stability would be the research goal of the immobilization.

Enzyme Immobilization；Bioenergy；Cross-linked enzyme aggregates （CLEAs）；Bionic Immobilization

Q814.2

A

1672－2868（2010）06－0082－07

2010－08-06

安徽省教育廳自然科學(xué)基金項目（項目編號：KJ2009B230Z），巢湖學(xué)院科研啟動項目

薛建躍（1963－），女，安徽無為人。副教授，研究方向：綠色化學(xué)與生物催化。

責(zé)任編輯：宏 彬