灑榮波，石貴陽，唐瑜菁

（1.泰山醫(yī)學院生物科學系，山東泰安271016；2.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214036）

不同補料發(fā)酵方式對重組畢赤酵母高密度培養(yǎng)的影響

灑榮波1，石貴陽2，唐瑜菁1

（1.泰山醫(yī)學院生物科學系，山東泰安271016；2.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214036）

目的：研究5L發(fā)酵罐中葡萄糖補料方式對重組畢赤酵母高密度培養(yǎng)的影響，為大規(guī)模工業(yè)化生產奠定基礎。方法：葡萄糖分批發(fā)酵階段結束以后，以不同的流加策略流加補料培養(yǎng)基。結果：分批發(fā)酵初始葡萄糖最佳濃度為10g/L；采用間歇補料和恒速流加補料方式培養(yǎng)畢赤酵母，發(fā)酵結束后菌體細胞干重分別為33.2g/L和41.5g/L，而采用指數(shù)流加補料方式，發(fā)酵前期和發(fā)酵后期控制比生長速率分別為0.20h-1和0.15h-1，發(fā)酵結束后菌體細胞干重可達53.4g/L。結論：采用分階段控制比生長速率的發(fā)酵策略，發(fā)酵結束后菌體細胞干重遠遠大于間歇補料和恒速流加補料發(fā)酵策略。

重組畢赤酵母，高密度培養(yǎng)，補料方式

甲醇營養(yǎng)型巴斯德畢赤酵母是一種具有表達率高、遺傳穩(wěn)定、產物可分泌等優(yōu)點的外源分泌蛋白和胞內蛋白表達的一種優(yōu)秀宿主［1］。它能夠生長在以甲醇作為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基上，擁有一條高效誘導的甲醇利用途徑。目前巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)在國內外的應用非常廣泛，到目前為止，已有數(shù)百種外源蛋白在該系統(tǒng)中得到表達［2］。按照Invitrogen公司對畢赤酵母的研究，外源蛋白在畢赤酵母中的表達分兩步，即菌體生長和蛋白誘導表達。先在以甘油或葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌體，達到一定OD值后無菌離心，收集菌體后在以甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中進行誘導表達。高密度發(fā)酵是基因工程菌提高外源蛋白表達水平的一種重要策略，迄今已有許多蛋白通過高密度發(fā)酵獲得高表達量［3-4］。畢赤酵母發(fā)酵產物的累積不會對自身產生毒副作用，且畢赤酵母的表達菌株很容易從搖瓶培養(yǎng)擴大到大批量高密度發(fā)酵，不影響外源基因的表達水平。這兩點注定了畢赤酵母具有可用于高密度發(fā)酵的巨大潛力［5］。筆者選取了一種廉價的工業(yè)化培養(yǎng)基，并對其進行優(yōu)化，使得此培養(yǎng)基在最佳培養(yǎng)條件下生產畢赤氏酵母的生物量達到最大。本文報道了在5L發(fā)酵罐中以不同補料方式對重組畢赤酵母高密度發(fā)酵的影響，為大規(guī)模工業(yè)化生產奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

表1 不同葡萄糖初始濃度的動力學參數(shù)

巴斯德畢赤氏酵母 pichia pastoris KM71（his4 arg4 aox1∷ARG4） 表達載體pPIC9k為Invitrogen公司產品，外源基因為粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）植酸酶基因，載體呈線性整合在染色體上，由江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室課題組構建；平板保存及活化培養(yǎng)基 YPD固體培養(yǎng)基（葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，瓊脂2%，pH自然）；種子培養(yǎng)基 YPD液體培養(yǎng)基（葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，pH自然）；發(fā)酵基礎培養(yǎng)基 葡萄糖1%，KH2PO40.7%，MgSO4·7H2O 0.03%、FeSO4· 7H2O 0.05%、MnSO4·H2O 0.05%，用25%氨水調節(jié)pH為5.5；發(fā)酵補料培養(yǎng)基 葡萄糖40%，MgSO4· 7H2O 10g/L；培養(yǎng)基滅菌條件 0.1MPa，121℃下滅菌20min。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子活化方法 見參考文獻［2］。

1.2.2 種子培養(yǎng)基的搖瓶培養(yǎng)法 見參考文獻［2］。

1.2.3 葡萄糖分批發(fā)酵培養(yǎng)方法 將搖瓶種子按10%接種量接入裝有3L發(fā)酵基礎培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，通氣量為1.5vvm，在堿液瓶中加入25%（V/V）濃氨水，發(fā)酵過程中培養(yǎng)液pH控制在5.5?？諝饬髁繛?.5vvm，轉速為800r/min時，接種前設定溶氧量（DO）為100%，當初始葡萄糖耗盡后開始流加補料液。

1.2.4 葡萄糖流加方法 在葡萄糖分批發(fā)酵階段結束以后，以不同的流加策略流加補料培養(yǎng)基直到菌體培養(yǎng)至所需密度。在此階段，依舊通過流加25%氨水保持pH恒定在5.5，調節(jié)通氣量和攪拌轉速使溶氧維持在20%以上。

1.3 分析方法

1.3.1 酵母細胞密度測定 見參考文獻［2］。

1.3.2 菌體生物量的測定 見參考文獻［2］。

1.3.3 葡萄糖濃度的測定 DNS法［6］。

1.3.4 pH的測定 發(fā)酵罐pH電極在線檢測。

1.3.5 溶氧（DO）的測定 發(fā)酵罐溶氧電極在線檢測。

2 結果與討論

2.1 5L發(fā)酵罐分批培養(yǎng)初始葡萄糖濃度的確定

為了獲得更高的葡萄糖細胞得率，必須使初始培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度能使培養(yǎng)菌以較快的速度產生菌體，為此進行了葡萄糖初始濃度的搖瓶實驗。實驗結果及動力學參數(shù)如圖1及表1所示。從中可以看出，隨著葡萄糖濃度的升高，最終細胞干重（DCW）也隨之增加，但最大細胞生產強度及葡萄糖的細胞得率卻有所不同，葡萄糖濃度為10g/L時的最大細胞生產強度及細胞平均產率最大，30g/L濃度的葡萄糖最大細胞生產強度及細胞平均產率最低。綜合考慮，我們選擇5L罐分批培養(yǎng)時的初始葡萄糖濃度為10g/L。

圖1 不同葡萄糖初始濃度與菌體生長的關系

2.2 生長期碳源葡萄糖補料方式的探索基因工程菌發(fā)酵應在保證基因表達的前提下盡量提高菌體密度，這樣才能提高工作效率以利于后期的分離、純化［7］。在分批培養(yǎng)的生長期進行流加補料可實現(xiàn)畢赤酵母工程菌的高密度培養(yǎng)，為產酶期提高植酸酶表達分泌水平奠定堅實基礎。我們實驗了生長期葡萄糖的不同流加方式對工程菌生長的影響。

2.2.1 間歇補料發(fā)酵 間歇補料是一種常見的流加發(fā)酵方式，實驗中補料量70mL/次，64h結束發(fā)酵，總共補料量為560mL葡萄糖，折合葡萄糖224g，實驗過程的動力學曲線如圖2所示。從圖中可以看出，隨著發(fā)酵進行，補料開始時剩余葡萄糖量隨之增多。考慮到補料量及菌體培養(yǎng)的經濟性，我們選擇在64h時停止發(fā)酵，最終達到的酵母細胞干重為33.2g/L。

圖2 間歇補料發(fā)酵的動力學曲線

2.2.2 恒速流加補料發(fā)酵 實驗中在分批發(fā)酵結束后，以5mL·L-1·h-1的恒定速率流加補料液，每4h取樣測定發(fā)酵液中的殘?zhí)菨舛燃熬w密度，56h時補料結束，共補料600mL，折合葡萄糖240g。實驗過程的動力學曲線如圖3所示。從圖中可以看出，補料開始后的24h內，菌體密度增加較快，細胞干重基本上呈線性增加，補入的葡萄糖也全部耗盡，發(fā)酵液中的殘?zhí)腔揪S持在0.2g/L附近；補料24h之后，發(fā)酵液中的殘?zhí)菨舛乳_始增加，隨著補料時間的延長，殘?zhí)菨舛仍絹碓礁撸?6h時殘?zhí)且迅哌_2.8g/L，因此此時停止補料，發(fā)酵結束，最終細胞干重可達41.5g/L。

圖3 恒速補料發(fā)酵的動力學曲線

2.2.3 指數(shù)流加發(fā)酵 Yee L［8］認為目前最成功的基因工程菌高密度培養(yǎng)的方法是指數(shù)流加法。理想的微生物生長是菌體量相對時間以指數(shù)函數(shù)增加，故可以使流加物料量以時間的指數(shù)函數(shù)增加。指數(shù)流加進料速率與時間的關系為

式（1）中，F(xiàn)（t）為t時刻葡萄糖的流加速率，L·h-1；V0為補料開始時刻的發(fā)酵液體積，L；X0為補料開始時的菌體濃度，g·L-1；μset為設定的比生長速率，它要滿足的一個條件是：μset＜μmax；YX/S為菌體對底物的得率系數(shù)；t是發(fā)酵時間，h；SF是流加葡萄糖的濃度，g·L-1；S是罐內葡萄糖的濃度，g·L-1。實驗中V0=3L，X0=4.1g·L-1，YX/S由分批發(fā)酵數(shù)據計算為0.41g·g-1，SF=400g·L-1。通過流加發(fā)酵動力學模型對畢赤酵母分批發(fā)酵的菌體生長曲線進行擬合，得到菌體生長動力學模型為：

式（2）中X為菌體濃度，g·L-1，t是發(fā)酵時間，h。該模型能夠很好地擬合菌體對數(shù)生長期和穩(wěn)定期的變化趨勢，回歸的R2值為0.997，結合菌體生長動力學模型計算求得實驗最大比生長速率 μmax= 0.385h-1，原則上只要我們所取的μset值小于0.385h-1就可以了，實驗中初步設定μset=0.15h-1。指數(shù)流加補料的動力學曲線如圖4所示。

圖4 指數(shù)流加補料的動力學曲線（μset=0.15h-1）

從圖中可以看出，指數(shù)流加補料開始之后，發(fā)酵液中的葡萄糖濃度一直維持在0水平，說明加入的葡萄糖被完全消耗，DO值也在發(fā)酵全過程保持在20%以上，發(fā)酵進行到52h時停止補料，此時細胞干重達到最高為39.7g/L。由于實驗所設定的μset在較低的0.15h-1，補入的葡萄糖很快被酵母利用，畢赤酵母的生長仍處于葡萄糖限制生長的狀態(tài)，三羧酸循環(huán)的周轉能力還沒有達到飽和狀態(tài)。如果畢赤酵母攝入的底物過多，比生長速率大于一定的閾值后很容易積累乙醇，這個閾值一般在0.14～0.5h-1范圍內［11］，因此本實驗所設定的比生長速率是較為保守的。

為了確定最佳的比生長速率，我們又進行了一次μset=0.20h-1的實驗，實驗結果如圖5所示。從圖中可以看出，當我們提高了比生長速率后，葡萄糖的流加速率也相應隨之增加，52h結束發(fā)酵時，最大細胞干重為44.1g/L。整個過程流加了葡萄糖補料液800mL，但所得到的菌體干重卻僅為μset=0.15h-1時的1.2倍，沒有明顯的增加。從圖中的DO曲線可以看出：在發(fā)酵的前36h，發(fā)酵液中的DO值可以保持在20%以上，但36h（此時已補料20h）以后，DO值持續(xù)下降，40h已下降到12%，48h的DO值已接近為0，說明此時的細胞生長旺盛，需氧較多，單純依靠提高攪拌轉速與通氣量已不能滿足DO值大于20%，此時葡萄糖已有一部分進入了厭氧發(fā)酵途徑，而沒有用來生長菌體，從而造成了葡萄糖的浪費。

圖5 指數(shù)流加補料的動力學曲線（μset=0.20h-1）

為了達到更高的菌體密度，實驗中我們采取這樣一種補料策略：為了讓酵母生長更快一些，我們可以采用分階段設定比生長速率的方法來進行畢赤酵母的上罐發(fā)酵。在指數(shù)補料階段的前20h，我們可以設定 μset=0.20h-1；而在 20h以后，設定 μset= 0.15h-1。這樣可以在補料前期不影響酵母菌體的生長，而在補料后期又不會造成酵母生長過于旺盛、溶氧太低而進行厭氧發(fā)酵。驗證實驗如圖所示。

圖6 指數(shù)流加補料的動力學曲線（分階段控制比生長速率）

實驗結果達到了本實驗的預期目的，整個發(fā)酵過程的DO值一直控制在20%以上，補料階段的殘?zhí)菨舛纫惨恢本S持在0水平，最終達到53.4g/L的菌體密度，比前兩次指數(shù)流加實驗都有所提高。

3 討論

在本文中，我們通過在指數(shù)流加過程中分階段設定不同的比長速率來控制葡萄糖的流加速率，使發(fā)酵液中的碳源濃度維持在接近0的水平，可維持較高的溶氧水平，很好地解決了發(fā)酵進行到36h時溶氧水平降為0的矛盾。實驗中由于上罐次數(shù)的限制，僅實驗了比生長速率分別為0.15h-1和0.20h-1，旨在發(fā)現(xiàn)其中規(guī)律。根據所建立的動力學模型，提出了分階段控制比生長速率的方法，發(fā)酵前20h和20h以后控制比生長速率分別為0.20h-1和0.15h-1，最終菌體細胞干重達到53.4g/L，比控制恒定比生長速率時的菌體細胞干重有所提高。

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Influence of different feeding strategies on high density culture of recombinant pichia pastoris

SA Rong-bo1，SHI Gui-yang2，TANG Yu-jing1
（1.Bioscience Department，Taishan Medical University，Taian 271016，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214036，China）

Objcetive：To develop the influence of three different feeding strategies on high density culture of recombinant pichia pastoris.Method：Medium was fed in different feeding strategies after batch fermentation ended.Results：The optimum concentration for glucose was 10g/L in batch fermentation.The dry cell weight were 33.2g/L and 41.5g/L respectively in intermission and constant velocity fed-batch fermentation.When the specific growth rate was controlled 0.20h-1and 0.15h-1prophase and anaphase of the fermentation，the dry cell weight in exponential fed-batch processes was 53.4g/L.Conclusion：The dry cell weight with different specific growth rate was higher than the other two fermentation strategies.

recombinant pichia pastoris；high density culture；feeding strategy

TS201.3

A

1002-0306（2010）11-0210-04

2009-11-04

灑榮波（1978-），男，講師，碩士，研究方向：微生物發(fā)酵。

泰山醫(yī)學院青年科學基金項目（2008-2009）。