周術(shù)濤，雷志力，俞巧仙，葉智根

（森宇控股集團(tuán)有限公司，浙江義烏322000）

均勻設(shè)計(jì)與正交設(shè)計(jì)聯(lián)用優(yōu)選鐵皮石斛多糖提取工藝的研究

周術(shù)濤，雷志力，俞巧仙，葉智根

（森宇控股集團(tuán)有限公司，浙江義烏322000）

目的：優(yōu)選簡(jiǎn)便高效的鐵皮石斛多糖的提取工藝，考察不同條件下的總多糖得率。方法：采用均勻設(shè)計(jì)與正交設(shè)計(jì)聯(lián)用的方法對(duì)鐵皮石斛多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。結(jié)果：優(yōu)選出來(lái)的鐵皮石斛最佳提取工藝條件為溫度85℃，提取時(shí)間3h，液料比20倍時(shí)，提取的總多糖得率最高為24.9%。結(jié)論：正交設(shè)計(jì)與均勻設(shè)計(jì)聯(lián)用是優(yōu)選工藝的好方法，本實(shí)驗(yàn)所得工藝合理，提取率高，適用于工業(yè)生產(chǎn)。

均勻設(shè)計(jì)，正交設(shè)計(jì)，鐵皮石斛多糖，提取工藝

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）為蘭科石斛屬藥用植物，又名黑節(jié)草，是一種非常珍貴的中藥，具有益胃生津、滋陰清熱、潤(rùn)肺止咳的功效。臨床一般將其用于治療陰傷津虧，口干煩渴，食少干嘔，病后虛熱，目暗不明等疾病，特殊用于慢性萎縮性胃炎及降血糖、抗腫瘤、抗衰老等?，F(xiàn)代藥理研究表明，其主要成分是鐵皮石斛多糖，能顯著提高SOD（超氧化物歧化酶）水平，從而降低LPO（過(guò)氧化脂質(zhì)），達(dá)到清除體內(nèi)自由基的作用。鐵皮石斛生理活性的強(qiáng)弱與其多糖的含量有一定關(guān)系，常以其高低來(lái)判斷某一石斛類(lèi)藥材質(zhì)量的好壞。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)均勻設(shè)計(jì)粗選鐵皮石斛多糖提取工藝，并在此基礎(chǔ)上選取水平因素范圍做正交實(shí)驗(yàn)，采用直觀(guān)分析的方法對(duì)鐵皮石斛多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，均勻設(shè)計(jì)與正交設(shè)計(jì)的聯(lián)用，從而使優(yōu)選出的工藝更加優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵皮石斛 干燥莖，由浙江省森宇實(shí)業(yè)有限公司提供；葡萄糖 分析純，北京慶盛大化工技術(shù)有限公司。

KQ-250DE型數(shù)控超聲波 昆山市超聲儀器有限公司；UV-9200紫外分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；TDL-5型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鐵皮石斛多糖含量測(cè)定方法的確定 多糖在濃硫酸作用下可以被水解成單糖，單糖在濃硫酸作用下脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10～100μg范圍內(nèi)，其顏色的深淺與糖的含量呈正比，且在490nm波長(zhǎng)下有最大吸收峰，故可用硫酸-苯酚（5%）法［2］顯色，再采用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.1.1 5%苯酚溶液的配制 取苯酚適量，蒸餾收集180～182℃的餾分，稱(chēng)取餾分12.5g，置250mL的容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得5%苯酚溶液，將溶液避光，冷藏。

1.2.1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱(chēng)取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品3.125g，將其定容于250mL容量瓶中，吸取2mL溶液定容于100mL的容量瓶中，搖勻，得到濃度為250μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5mL分別置于50mL容量瓶中定容，精密吸取上述供試液1.0mL于試管中，分別加入5%苯酚溶液0.6mL，濃硫酸3.0mL，充分搖勻，放置60℃水浴中20min，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，求得回歸方程式：

式中，X為糖濃度，μg/mL；Y為吸光度值；n=5。

由回歸方程可知，糖濃度在12.5～62.5μg/mL之間有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

1.2.2 樣品中總多糖得率的計(jì)算 精密量取1.0mL的供試品溶液，定容于適當(dāng)體積的容量瓶中，搖勻。精密吸取上述稀釋液1.0mL于試管中，分別加入5%苯酚溶液0.6mL，濃硫酸3.0mL，充分搖勻，放置60℃水浴中20min，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（Y），代入回歸方程求得多糖濃度（C）。

式中，C為多糖濃度，mg/mL；Y為吸光度；n為稀釋倍數(shù)。

鐵皮石斛粉質(zhì)量為m，提取液體積為V，則由式（3）求得總糖得率W：

式中，C為多糖濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；m為石斛粉質(zhì)量，g；W為石斛粉質(zhì)量，%。

1.2.3 提取工藝 將干燥鐵皮石斛粉碎，過(guò)60目篩。取一定量鐵皮石斛粉，熱水浸提，調(diào)節(jié)適當(dāng)溫度和液料比，保溫提取一定時(shí)間（提取3次），過(guò)濾，濾液經(jīng)醇析，離心得粗多糖，復(fù)溶脫蛋白，醇析得粗多糖，采用苯酚硫酸法測(cè)量鐵皮石斛多糖的含量。提取工藝流程如下：

原料→稱(chēng)重→熱水浸提→過(guò)濾濾液醇析→離心得多糖粗品→復(fù)溶→脫蛋白→醇析→粗多糖→計(jì)算總多糖得率

表1 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平表

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1 均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，以鐵皮石斛總糖為考察指標(biāo)，第6號(hào)實(shí)驗(yàn)所得總多糖提取率較高。此時(shí)工藝條件為：溫度 90℃，時(shí)間2.5h，液料比18倍。

表3 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

從均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析來(lái)看，以均勻設(shè)計(jì)6號(hào)的實(shí)驗(yàn)的各因素的水平數(shù)為基準(zhǔn)上下浮動(dòng)取值，也可考慮單水平作用效果，對(duì)各因素的水平進(jìn)行合理取值，在此基礎(chǔ)上，正交實(shí)驗(yàn)的因素水平表設(shè)計(jì)如表2；表4為正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果。

表4 正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

由表4可知，對(duì)得率影響最大的因素是提取溫度，其次是液料比，再次是提取時(shí)間。鐵皮石斛多糖的最優(yōu)工藝條件為：A2B3C3，即提取溫度為85℃，提取時(shí)間3h，液料比為20倍。經(jīng)測(cè)定，在此最優(yōu)工藝下，鐵皮石斛多糖的得率可達(dá)24.9%。

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)均勻設(shè)計(jì)與正交設(shè)計(jì)聯(lián)用，篩選得最佳工藝條件為：提取溫度為85℃，提取時(shí)間3h，液料比為20倍。

3.2 均勻設(shè)計(jì)與正交設(shè)計(jì)聯(lián)用的優(yōu)點(diǎn)：將兩種設(shè)計(jì)方法有機(jī)結(jié)合，可以揚(yáng)長(zhǎng)避短，無(wú)論在藥理學(xué)研究還是在制劑生產(chǎn)工藝參數(shù)的優(yōu)化研究中，都可以在省時(shí)、省力、省錢(qián)的基礎(chǔ)上在整個(gè)實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)盡快找到最佳的提取工藝條件，使均勻設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)次數(shù)大為減少，使正交設(shè)計(jì)能夠進(jìn)行直觀(guān)分析的優(yōu)點(diǎn)在藥學(xué)研究中更好地發(fā)揮出來(lái)。

3.3 由于正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)次數(shù)的跳躍性和均勻設(shè)計(jì)分析對(duì)分析人員的數(shù)理統(tǒng)計(jì)知識(shí)的嚴(yán)格要求等條件因素，使這兩種設(shè)計(jì)方法在藥學(xué)研究中的應(yīng)用受到一定程度的限制。將均勻設(shè)計(jì)與正交設(shè)計(jì)聯(lián)用是有其理論基礎(chǔ)的，對(duì)均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)而言，如果沒(méi)有計(jì)算機(jī)處理數(shù)據(jù)，也可以從實(shí)驗(yàn)中找到一個(gè)最優(yōu)的指標(biāo)，相應(yīng)實(shí)驗(yàn)的條件為優(yōu)選的工藝條件，這種方法建立在均勻性的基礎(chǔ)之上，由于實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分散均勻，實(shí)驗(yàn)中最優(yōu)的工藝條件離實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的最優(yōu)工藝條件不是很遠(yuǎn)，所以還是有效的。

［1］Li W M，Gao Y，Li D H.Application of uniform design method used to select proportion of ingredients in Houpuwan［J］. Chin J Exp Trad it Med Form，2001（2）：18-20.

［2］羅立新，姚汝華.靈芝多糖生產(chǎn)工藝的研究［J］.食品工業(yè)科技，1996（6）：60-62.

［3］熊麗萍，萬(wàn)屏南，衷友泉.幾種石斛多糖的提取分離及其抗氧化性能研究［J］.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，18（4）：55-56.

［4］何鐵光，楊麗濤，李陽(yáng)瑞，等.鐵皮石斛原球莖多糖提取最佳工藝研究［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，15（5）：240-243.

［5］王海波，沙明，邸學(xué).均勻設(shè)計(jì)法與正交設(shè)計(jì)法在復(fù)方工藝中應(yīng)用比較［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2005，32（1）：71-72.

［6］路世鵬，王玉蓉.均勻設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選吳茱萸提取工藝的研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27（5）：66-69.

［7］張?zhí)m蘭，黃昌全，張忠義，等.均勻設(shè)計(jì)與正交設(shè)計(jì)在鉤吻生物總堿提取工藝篩選研究中的應(yīng)用［J］.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，23（9）：914-924.

Study on the preferred extraction of polysaccharides from dendrobium candidum with uniform design and orthogonal design

ZHOU Shu-tao，LEI Zhi-li，YU Qiao-xian，YE Zhi-gen
（Senyu Holding Group Co.，Ltd.，Yiwu 322000，China）

Objective：Simple and efficient extraction process of polysaccharides from dendrobium candidum was optimized，the yield of the total polysaccharides under different conditions was investigated.Methods：Uniform design and orthogonal design methods were used to optimize the process of extracting polysaccharide.Results：The optimal extraction condition was temperature 85℃，extraction time 3h，liquid material ratio 20 times，the highest total polysaccharides extracted rate was 24.9%.Conclusion：Orthogonal design combined with uniform design was a good way for process optimization.The process obtained by the experiment with high extraction rate was reasonable and suitable for industrial production.

uniform design；orthoganal design；dendrobium candidum polysaccharide；extraction

TS201.1

B

1002-0306（2010）11-0296-03

2009-11-13

周術(shù)濤（1982-），男，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物及中藥工藝制備。