張璐，李春生，趙峰，林子清

（中國(guó)刑事警察學(xué)院 法醫(yī)學(xué)系，沈陽 110035）

狗是一種常見的犬科哺乳動(dòng)物，屬狼的近親，也是飼養(yǎng)率最高的寵物。對(duì)狗的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及骨組織工程方面的研究較多，但對(duì)其骨組織形態(tài)學(xué)的研究報(bào)道較少，目前國(guó)內(nèi)外的學(xué)者也只是對(duì)其骨組織形態(tài)的部分特征進(jìn)行了簡(jiǎn)單的描述。本研究將狗股骨中段做成骨骼組織學(xué)切片后采用硫堇苦味酸染色法進(jìn)行染色，觀察其鏡下結(jié)構(gòu)，以期對(duì)其骨組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料

在集市上購(gòu)買2年生以上家犬50只，雌雄不限，體質(zhì)量20~50 kg，采用靜脈輸入過量麻醉藥物的方法處死后取其右后股骨的中段備檢。

1.2 方法

1.2.1 固定：取上述檢材，將股骨中段鋸成厚3~5 mm的橫段，放入10%福爾馬林溶液中固定3~5 d。

1.2.2 脫鈣：分別按照Murayama法和Alexander法配制甲酸脫鈣液和硝酸脫鈣液［1］。

1.2.3 包埋切片：將脫鈣后的骨組織流水沖洗24 h后，用冷凍組織包埋劑（OCT）包埋，放在冷凍切片機(jī)（英國(guó)Brother公司）冷凍室內(nèi)3~5 min，使其完全凍結(jié)后，切成20 μm厚的薄片，放入無水乙醇中備用。

1.2.4 染色封片：按常規(guī)配制硫瑾/苦味酸染色液，室溫下采用游離方法染色，用中性合成樹膠封片［2］。

1.2.5 切片觀察指標(biāo)：采用Nikon ECLIPSE 80i病理圖像處理系統(tǒng)200倍鏡下觀察哈氏系統(tǒng)的數(shù)量、形態(tài)、直徑、面積及排列，間骨板的數(shù)量、形態(tài)、排列、面積百分比、環(huán)層骨板形態(tài)，內(nèi)、外環(huán)骨板的厚度及相對(duì)厚度，非哈氏管的數(shù)量。400倍鏡下觀察哈氏系統(tǒng)環(huán)層骨板數(shù)，哈氏管直徑及面積，間骨板環(huán)層骨板數(shù)，骨陷窩數(shù)量、排列和面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，利用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 外環(huán)骨板和內(nèi)環(huán)骨板

狗股骨外環(huán)骨板60%沒有完整的結(jié)構(gòu)，形態(tài)多不連續(xù)，厚薄不等，平均厚度（135.11±63.91）μm。平均相對(duì)厚度0.877，與內(nèi)環(huán)骨板相同，均主要以呈層狀排列的梭形骨細(xì)胞的形式存在。梭形細(xì)胞較小，排列比較致密，有些細(xì)胞呈條狀，外環(huán)骨板形態(tài)較內(nèi)環(huán)骨板明確（圖1）。

圖1 狗股骨火棉膠切片 ×200Fig.1 Collodion slice of the dog×200

內(nèi)環(huán)骨板平均厚度（98.86±49.99）μm，平均相對(duì)厚度0.065。內(nèi)環(huán)骨板厚薄不均，有少數(shù)骨單位的部分內(nèi)環(huán)骨板不連續(xù)。內(nèi)環(huán)骨板大多分層不明顯，梭形細(xì)胞較大，排列比較疏松，但骨單位均不向骨髓腔內(nèi)突入（圖2）。

圖2 狗股骨火棉膠切片 ×200Fig.2 Collodion slice of the dog×200

2.2 骨單位

骨單位從形態(tài)上可以分為規(guī)則和不規(guī)則骨單位兩種，嵌到內(nèi)外環(huán)骨板中的骨單位僅有1層環(huán)纖維骨板，中央管徑較小。骨密質(zhì)中的骨單位多為第一代骨單位，可見少量第二代骨單位。平均有4層骨細(xì)胞構(gòu)成的環(huán)纖維骨板邊緣較清。哈佛系統(tǒng)平均直徑（133.40±19.01）μm，其面積平均（14147.82±4383.66）μm2，邊緣較清晰，圓形或類圓形，其中以圓形為主。環(huán)纖維骨板較厚，邊緣境界較清晰。哈氏管直徑相對(duì)較大，其平均直徑（23.44±7.27）μm，其面積平均（466.86±293.99）μm2。間骨板較少，條索狀或半月狀無規(guī)律填充于骨單位之間。骨細(xì)胞多為短梭形或菱形，排列不規(guī)則，髓質(zhì)側(cè)的哈佛系統(tǒng)多而大，邊緣較清晰，排列較皮質(zhì)側(cè)規(guī)則。皮質(zhì)側(cè)的哈佛系統(tǒng)少而小，哈氏管面積相對(duì)較大（圖3）。

圖3 狗股骨火棉膠切片 ×200Fig.3 Collodion slice of the dog×200

2.3 骨陷窩

骨陷窩數(shù)量較多，鏡下一個(gè)視野內(nèi)54~135個(gè)，平均為（93.04±18.96）個(gè)。靠近皮質(zhì)側(cè)的骨陷窩呈梭形，有層狀排列的趨勢(shì)。中部或靠近內(nèi)環(huán)骨板處的骨陷窩排列不規(guī)則，形態(tài)也多呈圓形或類圓形。骨陷窩大小不均，最大 174.35 μm，最小 15.00 μm，平均（37.34±10.44）μm。各骨陷窩周圍可見較多的呈放射狀排列的骨小管，各骨陷窩之間的骨小管相互交錯(cuò)和連接。

2.4 非哈氏管

非哈氏管數(shù)量平均為（0.32±0.44）個(gè)。最多者每個(gè)視野中有2個(gè)，大多數(shù)沒有非哈氏管。排列不規(guī)則，無規(guī)律性，大小不等，形狀不一。

2.5 叢狀骨

有6例內(nèi)外骨板間幾乎全部為叢狀骨，其余少數(shù)近皮質(zhì)側(cè)有不明顯的叢狀骨，髓質(zhì)側(cè)沒有叢狀骨。

2.6 骨小梁及骨單位帶

未見。

3 討論

由于狗的存在具有悠久的歷史，和人類有著密切的關(guān)系，在生物學(xué)、考古學(xué)、法醫(yī)學(xué)尤其是種屬鑒定等領(lǐng)域的研究中占有特殊地位。我們參照人的骨切片制作方法，系統(tǒng)探索了狗股骨的骨組織切片制作和染色條件，證明通過改良人的骨組織切片制作條件，完全能夠制作出充分顯示狗股骨微細(xì)結(jié)構(gòu)特征的骨組織切片。

從我們的研究結(jié)果來看，狗股骨內(nèi)、外環(huán)骨板不規(guī)則，排列不均，且分層不明。外環(huán)骨板較內(nèi)環(huán)骨板發(fā)達(dá)。從髓質(zhì)側(cè)到皮質(zhì)側(cè)的哈氏系統(tǒng)面積逐漸減小，中央管面積相對(duì)增加，哈氏系統(tǒng)的排列漸不規(guī)則，沒有骨小梁結(jié)構(gòu)。而人的外環(huán)骨板走行不規(guī)則，波狀彎曲，環(huán)層骨板間有體積較小的菱形的骨單位。內(nèi)環(huán)骨板與骨密質(zhì)部的骨單位相連，有明顯的分界。內(nèi)環(huán)骨板較厚，波狀走行、連續(xù)。近內(nèi)環(huán)骨板處可見密集的直徑較小的骨單位。人類骨組織間骨板較多，面積百分比大，大多呈新月形結(jié)構(gòu)。有典型的骨小梁結(jié)構(gòu)。說明狗骨組織與人類骨組織相近，但又有顯著的差異，據(jù)此特征可與人骨進(jìn)行鑒別［3，4］。

骨骼化是生物結(jié)構(gòu)復(fù)雜化的基礎(chǔ)，骨骼系統(tǒng)又是生物形態(tài)進(jìn)化的限制因素。本研究的檢驗(yàn)結(jié)果提示我們，觀察動(dòng)物骨骼的組織學(xué)形態(tài)，不僅能夠幫助我們判斷其種屬，還能在一定程度上推斷出其進(jìn)化程度。

［1］Kimball BA，Mishalamie EA.Gas chromatographic determination of sodium monofluoroacetate as the free acid in an aqueous solvent［J］.J Chromatogr，1993，634（2）：289-296.

［2］龔志錦，詹榕洲.病理組織制片與染色技術(shù)［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1994：280.

［3］張繼宗，王國(guó)吉，張懷東.人與動(dòng)物骨組織特征的比較研究［J］.刑事技術(shù)，2007，（5）：16-18.

［4］張繼宗.人類骨組織特征研究［J］.人類學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27（4）：325-330.