府曉丹，于波，李陽，姜振環(huán)，楊瀅，孟亮

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，沈陽 110001）

嚴(yán)重的心率失?？芍聲炟?、猝死等，安裝電子起搏器是這類患者的主要治療手段。近年來，隨著我國心臟疾病人數(shù)的逐年增加和人們對(duì)生活質(zhì)量要求的不斷提高，需要安裝電子起搏器的人數(shù)每年都在遞增。但電子心臟起搏器在長期應(yīng)用過程中，存在電池壽命短、易發(fā)生感染、不能完全模擬正常心跳順序等缺點(diǎn)。為彌補(bǔ)上述缺陷，應(yīng)用基因工程構(gòu)建生物起搏器的研究便應(yīng)運(yùn)而生。位于竇房結(jié)及心房區(qū)心肌細(xì)胞膜上的乙酰膽堿敏感鉀通道與心動(dòng)過緩有關(guān)，該通道主要由Kir3.1基因編碼，本研究旨在篩選能夠抑制Kir3.1的siRNA，應(yīng)用RNA干擾的方法抑制Kir3.1蛋白的表達(dá)，以期為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供技術(shù)性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性Wistar新生大鼠40只（中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（Hyclone公司），胰蛋白酶（Sigma公司），Trizol和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000（Invitrogen公司），Real-time PCR試劑盒及PCR擴(kuò)增引物（北京天根生物有限公司），兔抗鼠Kir3.1多克隆抗體（Santa Cruz公司），辣根酶標(biāo)記山羊抗兔抗體（北京中山公司），小鼠抗大鼠β-actin抗體（Sigma公司），辣根酶標(biāo)記兔抗小鼠抗體（北京中山公司），PVDF膜（Millipore公司），siRNA由上海吉瑪制藥有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：采用低濃度的胰酶和Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化，并采取2次差速貼壁法純化心房肌細(xì)胞。在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)新生SD大鼠心房肌細(xì)胞，細(xì)胞懸液以2 ml/孔接種于6孔板中，48 h后細(xì)胞融合可達(dá)到80%左右。委托上海吉馬制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成3對(duì)針對(duì)Kir3.1基因的小干擾RNA（表1）。分別將3個(gè)片段的siRNA溶于DEPC水中，參照LipofectamineTM2000說明書，用Opti-MEM分別稀釋siRNA和脂質(zhì)體，將兩者混合后轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，4～6 h后換含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)并于24，48，72 h后檢測各指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)分為3組，對(duì)照組只加脂質(zhì)體，不加任何siRNA；陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染不針對(duì)任何靶基因的siRNA；實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染靶向Kir3.1基因的siRNA（siRNA∶脂質(zhì)體=2∶1）。

表1 針對(duì)Kir3.1基因設(shè)計(jì)的3對(duì)siRNA序列Tab.1 3 siRNA sequences designed against Kir3.1 gene

1.2.2 Real-time PCR反應(yīng)檢測Kir3.1mRNA：將細(xì)胞消化入RNase-Free 1.5 ml離心管中，加入1 ml Trizol，按試劑盒說明提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系共 10 μl，包括緩沖液 2 μl，復(fù)合酶 10.5 μl，寡核苷酸 0.5 μl，DEPC 水 7 μl。采用實(shí)時(shí)定量PCR儀（BIOER公司）擴(kuò)增Kir3.1cDNA及內(nèi)參GAPDH，Kir3.1的上游引物為：5′-AAGTGGCGTTGGAACCTCT-3′； 下 游 ：5′-GATGTAGCGGTAGCCATAG-3′。GAPDH上游引物為：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游為：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′，反應(yīng)體系為：cDNA 1.5 μl，上、下游引物各 1.0 μl，PCR mix 10 μl，ddH2O 6.5 μl，按下述條件進(jìn)行反應(yīng)：95℃10 min，95℃10 s；58℃20 s，68 ℃ 40 s，35 個(gè)循環(huán)。并采用 2-△△Ct法計(jì)算Kir3.1mRNA的相對(duì)含量。

1.2.3 Western blot檢測Kir3.1蛋白表達(dá)：細(xì)胞收集于1.5 ml離心管中，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，超聲破碎細(xì)胞，離心后提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測蛋白濃度，蛋白上樣量為80 μg，體系為20 μl。配制12%聚丙烯酰胺凝膠，煮樣后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉（5%脫脂牛奶）、一抗4℃孵育過夜（Kir3.1為1∶500稀釋、β-actin為1∶1 000稀釋），洗膜45 min，加入過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h后電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL），應(yīng)用 Metamorph圖像分析軟件分析各組Kir3.1與β-actin的蛋白灰度值，以對(duì)照組Kir3.1與β-actin的比值為“1”，其余各實(shí)驗(yàn)組均與“1”比較即得到各組蛋白相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 小干擾RNA（siRNA）的篩選結(jié)果

原代心房肌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染3對(duì)siRNA 24 h后，Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)它們能夠抑制Kir3.1mRNA的表達(dá)，抑制率分別為（15.7±0.4）%、（24.2±0.2）%和（39.9±0.3）%，與對(duì)照組比較，siRNA-2、siRNA-3 組抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），siRNA-3組抑制率更高，因此選用siRNA-3做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 Real-time PCR檢測siRNA-3抑制Kir3.1 mRNA時(shí)效性

將40 nmol/L Kir3.1-siRNA轉(zhuǎn)染至心房肌細(xì)胞，24、48 、72、96 h 抽提其 RNA，逆轉(zhuǎn)錄，經(jīng)定量 PCR檢測，與對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)24 h時(shí)Kir3.1mRNA表達(dá)量開始下降，為對(duì)照組的（56±1）%；48及 72 h時(shí)下降更為明顯，分別為對(duì)照組的（49±3）%及（33±1）%（P<0.05），至 96 h時(shí)，為對(duì)照組的（88±4）%，抑制效果不顯著（P>0.05）。

2.3 Western blot檢測siRNA-3對(duì)Kir3.1蛋白表達(dá)的影響

轉(zhuǎn)染Kir3.1-siRNA 48及72 h后抽提蛋白，經(jīng)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，48及72 h后實(shí)驗(yàn)組Kir3.1蛋白水平均較對(duì)照組明顯下降，分別是對(duì)照組的（37±3）%和（19±2）%（P<0.01），見圖 1。

3 討論

病態(tài)竇房結(jié)綜合征是心臟竇房結(jié)及其鄰近組織病變，引起竇性心動(dòng)過緩和相關(guān)心腦供血不足癥狀［1］。人群發(fā)病率高，是威脅人類健康的常見心血管疾病之一，目前以安裝電子起搏器治療為主。隨著生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)的飛速進(jìn)展，生物起搏器可能成為電子起搏器治療病竇的有益補(bǔ)充［2］。近年來，多項(xiàng)研究成果為生物起搏的概念提供了直接證據(jù)［3～5］。

圖1 轉(zhuǎn)染siRNA后Kir3.1蛋白的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 The expression level of Kir3.1 protein after trasfection

乙酰膽堿敏感性鉀通道（muscarinic acetylcholine-sensitive K+channel，KAch）是心房特異性離子通道，它極少分布于心室?。?］，由Kir 3.1和Kir 3.4共同組成。心臟迷走神經(jīng)通過釋放的乙酰膽堿，作用于心房肌細(xì)胞M2A-ChR-G蛋白-IK，Ach通路，激活KAch通道，發(fā)揮其對(duì)心臟的調(diào)節(jié)作用，從而減慢心率［7］。Bettahi等［8］研究發(fā)現(xiàn) KAch通道的特性主要與Kir 3.1有關(guān)，Kir 3.1可增加KAch通道的活性。

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)的主要目的是高效特異性降解目標(biāo)信使RNA，阻斷翻譯蛋白質(zhì)的過程，從而抑制目標(biāo)基因的表達(dá)［9］。本技術(shù)抑制Kir 3.1基因?qū)嶒?yàn)研究的結(jié)果表明：24 h時(shí)Kir3.1mRNA表達(dá)量開始下降，48及72 h時(shí)下降最為明顯；Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，48及72 h后實(shí)驗(yàn)組Kir3.1蛋白水平均較對(duì)照組均明顯下降。可見人工合成的siRNA可明顯抑制Kir3.1mRNA和蛋白表達(dá)。

我們?cè)?個(gè)人工合成的siRNA寡核苷酸片段中篩選出抑制效率最高的片段siRNA-3，將其轉(zhuǎn)染至心房肌細(xì)胞并檢測Kir 3.1蛋白表達(dá)情況。為保證siRNA轉(zhuǎn)染效率最高，抑制Kir 3.1基因表達(dá)的效果最顯著，篩選便成為該研究的關(guān)鍵一步。這里選用Real-time PCR檢測3個(gè)siRNA片段轉(zhuǎn)染后心房肌細(xì)胞Kir3.1基因的表達(dá)情況，該方法靈敏度高，且定量精準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)利用RNAi技術(shù)成功下調(diào)了心肌細(xì)胞上Kir 3.1mRNA和蛋白的表達(dá)，初步探索了原代心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法，并篩選出了基因沉默效果最好siRNA寡核苷酸片段，為下一步體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究Kir 3.1蛋白變化在病竇發(fā)生發(fā)展中的意義奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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