編譯:梁雙慶 (大慶石油學(xué)院)審校:王洋 (大慶石油學(xué)院)

新的微生物方法在石油生產(chǎn)中的應(yīng)用

傳統(tǒng)微生物學(xué)的培養(yǎng)基方法應(yīng)用于微生物工藝會(huì)引起油田的酸化和微生物腐蝕,從而產(chǎn)生不適應(yīng)和矛盾的結(jié)果。任何培養(yǎng)步驟都幾乎可以改變種群特征,因此也就改變了任何評(píng)價(jià)都要使用的基礎(chǔ)結(jié)論。在過(guò)去10年里,獨(dú)立培養(yǎng)方法的發(fā)展為鑒別微生物特征、數(shù)量和在一定程度上確定其功能的各種分析方法提供了方便,可直接用于本源微生物種群。然而,發(fā)展至今其實(shí)際應(yīng)用相當(dāng)局限,直至最近才應(yīng)用于海洋工業(yè)。文章給出了這些新技術(shù)的特性和它們應(yīng)用于北海海洋石油生產(chǎn)經(jīng)常遇到的兩種情況的優(yōu)勢(shì)——硝酸鹽注入和微生物腐蝕。微生物工具是建立于對(duì)微生物的遺傳物質(zhì)檢測(cè)的基礎(chǔ)上。方法包括直接用顯微鏡觀察熒光原位雜交和直接提取細(xì)胞遺傳物質(zhì)來(lái)計(jì)算具體微生物種群的數(shù)量,例如定量聚合酶鏈反應(yīng)和變性梯度凝膠電泳。文章簡(jiǎn)要描述了這些相對(duì)新的分子技術(shù)。在硝酸鹽處理的儲(chǔ)層中,微生物種群的改變引起水的突進(jìn),可以鑒別關(guān)鍵微生物種群,因此,產(chǎn)生對(duì)引起體系酸化的微生物新的強(qiáng)化檢測(cè)方法。分子技術(shù)是最有力的確定微生物腐蝕過(guò)程的工具。

微生物學(xué) 培養(yǎng)基方法 酸處理 分子技術(shù) 定量聚合酶鏈反應(yīng) 變性梯度凝膠電泳

1 總述

1.1 傳統(tǒng)方法與新方法的對(duì)比

盡管培養(yǎng)基和計(jì)算方法已經(jīng)有了很大的發(fā)展,但現(xiàn)在普遍接受的只有1%～10%的活躍微生物是這些傳統(tǒng)方法培育的,因此要尋找可以應(yīng)用到大部分微生物,或整個(gè)微生物種群的方法。

有幾種方法可以檢測(cè)整個(gè)微生物種群,而不用考慮培養(yǎng)的限制。另外,獨(dú)立培養(yǎng)技術(shù)的結(jié)果可以更快得到 (幾個(gè)小時(shí)到幾天),而傳統(tǒng)培養(yǎng)基技術(shù)的結(jié)果多達(dá)30天才可獲得),因此需刺激產(chǎn)生快速反應(yīng)時(shí)間,如濫用生物殺蟲(chóng)劑或其他化學(xué)劑。

編譯:梁雙慶 (大慶石油學(xué)院)審校:王洋 (大慶石油學(xué)院)

1.2 獨(dú)立培養(yǎng)技術(shù)

獨(dú)立培養(yǎng)技術(shù)用于微生物鑒別和量化以及微生物功能的確定 (圖1)。

圖1 分子方法基于對(duì)微生物基因物質(zhì)的檢測(cè) (如DNA和RNA)

1.2.1 直接細(xì)胞計(jì)數(shù) (DAPI)

微生物細(xì)胞在稀釋的懸浮液中被收集到一個(gè)過(guò)濾器中,用熒光染料染色。染料與細(xì)胞的遺傳物質(zhì)相結(jié)合,過(guò)量的染料被沖洗掉,直接用落射熒光顯微鏡來(lái)計(jì)數(shù)。這是一種全面的計(jì)數(shù)法,并且適用于注入水和產(chǎn)出水。

1.2.2 熒光原位雜交 (FISH)

微生物種群中的遺傳物質(zhì) (如DNA和RNA)是每個(gè)物種所獨(dú)有的。使用核糖體RNA序列中堿基對(duì)中的16S亞基,基因探針可以探測(cè)到不同微生物種群或不同物種。在探針上加上熒光染料,可檢測(cè)附著在特定基因探針上的細(xì)胞。通過(guò)使用不同的熒光劑,一次可以對(duì)不止一組進(jìn)行染色,并且通過(guò)整體染色 (如DAPI)可獲得量化信息。FISH技術(shù)是一種成熟的量化活躍微生物的計(jì)數(shù)法,適用于注入水和產(chǎn)出水,并且可以鑒別特定的微生物種群,如硫酸鹽還原原核生物 (SRP)。

1.2.3 定量聚合酶鏈反應(yīng)

DNA從樣品中提取,這種提取包括存在的所有細(xì)胞中的信息。PCR使得特定的DNA目標(biāo)呈現(xiàn)指數(shù)遞增,使?jié)舛仍黾拥娇梢杂?jì)量的數(shù)量 (基因樣本大于109)。做調(diào)整后PCR可用來(lái)定量,稱(chēng)為實(shí)時(shí)qPCR。在方法中,PCR中有一個(gè)信號(hào)在每次循環(huán)之后都要測(cè)量,并與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)比,來(lái)決定特定微生物種群在這個(gè)樣本中的最初數(shù)量。qPCR的化驗(yàn)分析具有高度敏感性。

1.2.4 變性梯度凝膠電泳 (DGGE)

DGGE描述一個(gè)樣本中存在的不同微生物種類(lèi),因此是一種種群識(shí)別方法。含有大量微生物種類(lèi)的樣品在DGGE凝膠上提供相應(yīng)數(shù)量的波帶,波帶的位置和數(shù)量提供足夠的信息來(lái)比較不同樣本中的微生物種群。

當(dāng)必須對(duì)微生物種群進(jìn)行總體概述時(shí),這種方法經(jīng)常用于其他處理能力更好的方法之前,如qPCR。

1.2.5 分子技術(shù)在油田的應(yīng)用

分子描述法與培養(yǎng)基技術(shù)相比,提供的信息得到了改善。表1簡(jiǎn)述了分子描述技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)。分子方法來(lái)研究沉淀引起腐蝕的工作證明了一個(gè)分化的微生物群,提出微生物引起的腐蝕是由很多種類(lèi)引起的,而不是過(guò)去所預(yù)測(cè)的。使用分子方法來(lái)檢驗(yàn)微生物種群對(duì)腐蝕程度的影響的研究在例2中描述。

2 實(shí)例1

表1 各種分子技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

1.2.6 儲(chǔ)層酸化

在儲(chǔ)層和生產(chǎn)設(shè)備中最小化硫化物的生產(chǎn)可以通過(guò)向注入水中加入硝酸鹽來(lái)實(shí)現(xiàn)。加入硝酸鹽的目的是促進(jìn)硝化細(xì)菌 (NUB)的生長(zhǎng)來(lái)抑制SRP。

NUB和SRP二者間的轉(zhuǎn)變可以依靠傳統(tǒng)的培養(yǎng)基方法進(jìn)行檢測(cè),以在生長(zhǎng)介質(zhì)中不斷地稀釋和培育為基礎(chǔ)。減少硫酸鹽的微生物并沒(méi)有因?yàn)樽⑷胂跛猁}而被殺死,對(duì)于SRP活性的抑制可能無(wú)法用傳統(tǒng)的計(jì)數(shù)方法來(lái)表示。一些SRP有能力轉(zhuǎn)變?yōu)榈拖跛猁},并且可以在SRP和NUB的生長(zhǎng)介質(zhì)中生長(zhǎng)。例1深入地描述了硝酸鹽的注入。

1.2.7 化學(xué)處理的影響

目前的研究表明,確定生物殺蟲(chóng)劑的劑量對(duì)于對(duì)特定生長(zhǎng)介質(zhì)有反應(yīng)的部分微生物群的影響可能是不合適的。特別是如果微生物對(duì)生物殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生了抗藥性,培養(yǎng)基法的數(shù)據(jù)可能?chē)?yán)重低于其正常活動(dòng)的估計(jì)值。同樣,加入其他的化學(xué)藥劑 (如硫化氫吸附劑、除垢劑和破乳劑)可能會(huì)降低微生物的活性,如果監(jiān)測(cè)方法不測(cè)定整個(gè)微生物種群的數(shù)量,這種影響可能永遠(yuǎn)不會(huì)發(fā)現(xiàn)。

1.2.8 微生物腐蝕

微生物工藝產(chǎn)生的硫化物一般可以加速腐蝕速率。最近,微生物腐蝕被認(rèn)為僅限制SRP的活性,盡管用營(yíng)養(yǎng)基方法對(duì)腐蝕產(chǎn)物進(jìn)行分析來(lái)監(jiān)測(cè)SRP,也幾乎無(wú)法給出有意義的數(shù)據(jù)。最近,應(yīng)用

2.1 使用分子工具來(lái)監(jiān)測(cè)硝酸鹽誘導(dǎo)微生物種群

已經(jīng)證實(shí),持續(xù)注入含有硝酸鹽的海水對(duì)于控制儲(chǔ)層中硫化物生成是有效的。為了避免油層酸化,從2001年1月開(kāi)始,注入水中添加了硝酸鹽。4口井發(fā)生了海水突破,并且已經(jīng)檢測(cè)到硝酸鹽突破,產(chǎn)出水中SRP轉(zhuǎn)變成NUB,證實(shí)了硝酸鹽的影響。需要健全的監(jiān)測(cè)技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)和優(yōu)化持續(xù)的硝酸鹽處理。

2.2 Halfdan油田注水系統(tǒng)

2003—2004年對(duì) Halfdan油田注水系統(tǒng)的微生物研究表明,鑒別和量化細(xì)菌分子方法優(yōu)于培養(yǎng)基法。分子技術(shù)用于Halfdan油田海水注入管線的清蠟殘?jiān)鼧颖旧?成功地鑒別和量化了主要微生物種群。使用DAPI和FISH方法確定微生物群的總數(shù)。下面是具體使用的FISH探針 (第一代FISH探針)。

◇EUB338(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)(細(xì)菌)

◇ALF968(α-變形菌綱)

◇BET42a(β-變形菌綱)

◇GAM42a(γ-變形菌綱)

◇SRB385(δ-變形菌綱)

◇SRB385Db(δ-變形菌綱中的去硫細(xì)菌)

種系發(fā)育基因探針SRB385和SRB385Db的目標(biāo)是一些變形菌綱,即最普遍的SRP生物群。另一方面,NUB不會(huì)被一個(gè)或者一些基因探針檢測(cè)到,因?yàn)檫@種生理學(xué)特性分布在很多細(xì)菌種族之間,包括α-變形菌綱、β-變形菌綱和γ-變形菌綱,它們同樣包含不可以利用硝酸鹽的成員。

結(jié)果如下:

◇FISH方法比起最大或然數(shù) (MPN)法得到的數(shù)要準(zhǔn)確100倍。

◇活躍的微生物占總微生物計(jì)數(shù)的55%～66%。

◇FISH法測(cè)定δ-變形桿菌綱的數(shù)目占所有存在活躍微生物的7%～14%。這類(lèi)微生物在很多環(huán)境中一般是豐富的SRP。MPN技術(shù)和最優(yōu)化培養(yǎng)基結(jié)合結(jié)果表明沒(méi)有SRP存在。

◇β-變形菌綱占微生物中的一大部分,用EUB338(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)探針檢測(cè),占所有活躍微生物的50%以上。δ-變形桿菌綱根本不存在,只有很少量的γ-變形桿菌綱存在。很可能β-變形菌綱中的一個(gè)未知部分是NUB。因此,最大比例的NUB是50%。

◇分子技術(shù)與需要30天繁殖時(shí)間的傳統(tǒng)MPN技術(shù)相比時(shí)間更短 (一般是在幾天之內(nèi))。

Halfdan油田注入水的回流水中無(wú)硫化氫。但是,回流水表明存在占優(yōu)勢(shì)的SRP菌株,也可以將硝酸鹽作為最終電子接收器。菌株脫硫弧菌優(yōu)先應(yīng)用硝酸鹽,甚至在高硫酸鹽濃度存在的條件下,如海水。因此,可能小的生命力強(qiáng)的SRP占 Halfdan油田清管殘骸中活性微生物種群的7%～14%,能夠從硫酸鹽轉(zhuǎn)化為低硝酸鹽。

2.3 Halfdan油田生產(chǎn)系統(tǒng)

2005年對(duì) Halfdan 4口生產(chǎn)井中選出的水樣進(jìn)行了分子技術(shù)分析,生產(chǎn)井局部海水突破。局部海水突破發(fā)生在2002年,Halfdan生產(chǎn)井 HDA-03XA和HDA-07,因?yàn)樵谶@2口生產(chǎn)井和注水井HDA-12之間有流通路徑,海水突破后,在HDA-03XA和HDA-072口井中檢測(cè)出硝酸鹽和亞硝酸。另外,注水井 HDA-12和生產(chǎn)井HDA-03XA之間通過(guò) HDA-07井存在間接流通路徑。

微生物群的鑒別是使用FISH完成的,使用與Halfdan海水注入系統(tǒng)微生物研究中相同的探針。FISH探針同樣適用于古生細(xì)菌。

在HDA-07產(chǎn)出水中測(cè)得,標(biāo)準(zhǔn)的硝酸鹽和亞硝酸鹽的濃度分別為12 mg/L和9 mg/L,HDA-03XA產(chǎn)出水中為0.6 mg/L和0.3 mg/L。這些結(jié)果表明硝酸鹽和亞硝酸鹽在2口井直接連通路徑中被耗盡。

活躍細(xì)胞百分率 [應(yīng)用細(xì)菌探針EUB338(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)FISH法占DAPI法總細(xì)菌數(shù)的比例],在HDA-07和HDA-03XA這2口井中分別是20%和67%。表明在 HDA-07井中有高濃度的非活躍細(xì)胞 (包括死的)。在 HDA-03XA井中,低濃度的硝酸鹽和亞硝酸鹽與樣品中具有更多活躍細(xì)胞是一致的,更多的氮化合物被消耗。在 HDA-07井中,亞硝酸鹽濃度過(guò)高,使得大部分的細(xì)胞不活躍。

在HDA-07井中,δ-變形桿菌綱 (SRP)占全部細(xì)菌的2%(DAPI法測(cè)0.4%),HDA-03X井中為10%(DAPI法測(cè)4.7%)。在 HDA-03X中,更高濃度的δ-變形桿菌綱與其高硫化氫產(chǎn)量(25 kg/d)是一致的,HDA-07井的硫化氫產(chǎn)量為4 kg/d。因此,使用 FISH法,δ-變形桿菌綱探針確定的SRP數(shù)與2口井中硫化氫的產(chǎn)量有很好的一致性,結(jié)果如表2所示。

表2 ____H_D__A_-_07與HDA-03XA井的檢測(cè)數(shù)據(jù)

當(dāng)各種種類(lèi)的具體探針被用來(lái)鑒別主要的微生物群時(shí),發(fā)現(xiàn)2口井中占大多數(shù)是γ-變形桿菌綱和β 變形桿菌綱。隨著硝酸鹽和亞硝酸鹽在HDA-07與HDA-03XA 2口井之間直接流通通道中的消耗,β-變形桿菌綱在產(chǎn)出水中的比例上升,這表明在儲(chǔ)層中部分β-變形桿菌綱被亞硝酸鹽抑制,并隨著硝酸鹽的消耗而復(fù)活。

Halfdan產(chǎn)出水中 (海水突破)微生物組成與Halfdan注入海水有顯著的不同,因?yàn)樽⑷胨写嬖诜浅Ｉ俚摩?變形桿菌綱,產(chǎn)出水中高濃度的微生物表明微生物在儲(chǔ)層中繁殖。海洋體系中,使用有機(jī)物基質(zhì)如醋酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽可以使γ-變形桿菌綱相對(duì)于其他生長(zhǎng)慢的微生物更有競(jìng)爭(zhēng)力,因?yàn)棣?變形桿菌綱對(duì)有用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)快速反應(yīng)。

結(jié)果證明了分子方法可以用來(lái)監(jiān)測(cè)注入水和采出水中微生物種群。當(dāng)這些微生物種群被歸于特定的表現(xiàn)型態(tài) (如硫酸鹽的減少)時(shí),這些結(jié)果可以用來(lái)評(píng)價(jià)反微生物工藝的有效性。使用這些方法對(duì)關(guān)鍵微生物種群進(jìn)行檢測(cè),達(dá)到優(yōu)化化學(xué)劑加入的目的,如硝酸鹽和生物殺蟲(chóng)劑,以微生物負(fù)荷為基礎(chǔ)。這些目標(biāo)檢測(cè)對(duì)于石油工業(yè)具有很大的作用,可與目前的營(yíng)養(yǎng)基檢測(cè)技術(shù)相比。

3 實(shí)例2

3.1 使用微生物指紋鑒別法確定水垢樣本最可能的腐蝕過(guò)程

最近對(duì) Halfdan和Dan 2個(gè)油田腐蝕水垢的研究,為分子技術(shù)在固體腐蝕水垢中的應(yīng)用提供了便利?？朔缙趶脑徒M分和固體物質(zhì)中分離細(xì)胞和提取DNA的困難,將原油生產(chǎn)中微生物方面的分析提升到了一個(gè)新的高度。

3.2 鑒別水垢中的細(xì)菌和古生細(xì)菌

對(duì)Dan油田和 Halfdan油田中水垢的研究表明,使用分子技術(shù)對(duì)微生物水垢分析是可行的。很多技術(shù)已經(jīng)在應(yīng)用中:PCR放大技術(shù)、凝膠上相對(duì)數(shù)量基因樣本的比較、DGGE和基因排序。半定量的PCR分析表明,與采出水樣本相比,水垢沉積物包含高濃度的SRP。

DGGE結(jié)果表明,大部分的水垢包含了SRP和產(chǎn)甲烷菌,這些是微生物腐蝕的潛在因素。

下面描述了微生物種群和微生物菌株的鑒別。

3.2.1 SRP

三大類(lèi)的δ-變形桿菌已經(jīng)確定:脫硫單胞菌屬、脫硫八疊球菌屬、脫硫弧菌屬。脫硫單胞菌屬是脫硫原核生物,使用醋酸作為電子供體,它們不具有減少硫酸鹽的能力。脫硫八疊球菌屬屬于δ-變形桿菌綱的脫硫菌屬,已經(jīng)從油田中分離出來(lái)。脫硫弧菌屬會(huì)引起生物腐蝕,在石油工業(yè)中已引起大量的健康和安全問(wèn)題,研究的目標(biāo)是更好地理解脫硫弧菌屬和它作為電子接受體在硝酸鹽和硫酸鹽之間的轉(zhuǎn)變能力。

3.2.2 梭狀芽胞桿菌

已經(jīng)鑒別出一定量的梭狀芽胞桿菌會(huì)發(fā)酵出碳水化合物,生產(chǎn)出酪酸;一些能夠固定氮,其他的可以發(fā)酵出氨基酸。不同的梭狀芽胞桿菌已經(jīng)從儲(chǔ)層中分離出來(lái):乙二醇梭菌 (油廠污染水的酸代謝菌株)、互營(yíng)單胞菌屬 (從海洋生產(chǎn)井分離出來(lái)的硫酸鹽還原菌)、脫硫腸狀菌屬 (從熱油儲(chǔ)層中分離出來(lái)的硫嗜熱硫酸鹽還原菌)和韋榮氏菌科。

3.2.3 熱袍菌目

一種變化很少的細(xì)菌分支,熱袍菌屬生長(zhǎng)溫度相對(duì)適中,而該目其他的成員都是生長(zhǎng)在最優(yōu)溫度60～90℃的超嗜熱菌。它們使用硫而不是氧作為電子接受體,在新陳代謝中,產(chǎn)生硫化氫。熱袍菌目是厭氧的,但是可以忍耐一定程度的氧。

3.2.4 甲烷八疊球菌目 (古細(xì)菌)

甲烷八疊球菌目是厭氧產(chǎn)甲烷菌,可以形成多細(xì)胞的菌落。

3.2.5 產(chǎn)甲烷細(xì)菌 (古細(xì)菌)

古細(xì)菌成員都使用有限分解代謝的基質(zhì),它們一般是嗜氫的,使用 H2來(lái)減少CO2使其變成甲烷。一些成員可以用甲酸鹽、CO或者乙醇作為電子供體來(lái)減少CO2。另一些成員,甲烷球形菌屬使用H2來(lái)將甲醇變成甲烷。

3.2.6 球菌目 (甲烷熱球菌屬)(古細(xì)菌)

主要有兩個(gè)種類(lèi)。它們?cè)谝欢ǖV物中利用 H2、CO2和甲酸鹽作為甲烷熱球菌屬的電子供體進(jìn)行自氧生活。醋酸鹽、甲醇和甲胺不能作甲烷產(chǎn)物的基質(zhì)。有機(jī)碳源不會(huì)促進(jìn)生長(zhǎng)。

3.2.7 微生物影響腐蝕進(jìn)程

在一些例子中,生態(tài)或者非生態(tài)的產(chǎn)氫可能是產(chǎn)甲烷菌的重要能源,與一定數(shù)量的SRP一起在油田環(huán)境下生長(zhǎng)。醋酸鹽在北海油層中累積濃度達(dá)到20 mM,這可能是一種重要的能源,可以直接或者間接被甲烷熱球菌利用。

基于以上觀察,微生物活動(dòng)對(duì)腐蝕的影響很可能是整體作用的結(jié)果。

4 展望

分子方法為石油體系樣本中各種微生物種群的鑒別和量化提供了一個(gè)窗口。這些方法在傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)基方法基礎(chǔ)上有了很大的改進(jìn),因?yàn)閭鹘y(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)基法適用的微生物物種十分有限。有用數(shù)據(jù)數(shù)量及其復(fù)雜性水平隨著基因方法的使用得到提高。數(shù)據(jù)解釋和描述微生物生態(tài)學(xué)和相互作用的模型也成為研究的重要部分。

4.1 微生物作為活的生物傳感器

在石油生產(chǎn)中,這種方法把合適的微生物轉(zhuǎn)變?yōu)橛杏玫沫h(huán)境生物傳感器。微生物系統(tǒng)對(duì)改變作出反應(yīng)如季節(jié)變化,或者人工操作如生物殺蟲(chóng)劑處理。給定的細(xì)菌在給定的環(huán)境會(huì)繁殖或退化,這取決于它與微生物群中其他成員之間的競(jìng)爭(zhēng)。微生物可以被看作活的生物感應(yīng)器,分子檢測(cè)技術(shù)可以看作是從生物傳感器和體系中讀取數(shù)據(jù)的方法。

4.2 新方法——范例

對(duì)給定體系設(shè)計(jì)一個(gè)相應(yīng)的微生物檢測(cè):

(1)評(píng)價(jià)研究體系中整個(gè)微生物群。

(2)評(píng)價(jià)生態(tài)平衡和工藝對(duì)復(fù)雜微生物的影響。

(3)設(shè)計(jì)相關(guān)引物結(jié)合到智能診斷工具中。

在石油工業(yè),這些新方法的應(yīng)用已經(jīng)得到證實(shí):

◇檢測(cè)和控制微生物提高原油采收率工藝,檢測(cè)地層中生物表面活性劑產(chǎn)生的微生物;

◇評(píng)價(jià)硝酸鹽處理方法,由具體種類(lèi)的SRP或者硝酸鹽是否會(huì)影響硫化氫的生產(chǎn)來(lái)確定投入硝酸鹽的劑量;

◇選擇和優(yōu)化微生物殺蟲(chóng)劑的方法;

◇評(píng)價(jià)微生物腐蝕和減緩微生物腐蝕;

◇基于SRP的微生物突破預(yù)測(cè)儲(chǔ)層酸化;

◇基于大量水的監(jiān)測(cè)預(yù)測(cè)地面微生物工藝。

10.3969/j.issn.1002641X.2010.4.001

資料來(lái)源于美國(guó)《SPE Production&Operations》2009年2月

20090318)