邵諸君 王鳳羽 耿堯 豐慧根

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系 河南 新鄉(xiāng) 453000; 2.河南省人口與計(jì)劃生育科研院遺傳室 河南 鄭州 450002;3.河南省人口與計(jì)劃生育科研院遺傳室 河南 鄭州 450002; 4.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系 河南 新鄉(xiāng) 453000)

苯丙酮尿癥(phenylketonuria;PKU)是比較常見的單基因遺傳代謝病,屬常染色體隱性遺傳,OMIM編號(hào)為261600。PKU是由苯丙氨酸羥化酶(Phenylalanine hydroxylase,PAH)基因突變導(dǎo)致的肝臟該酶活性降低或喪失所致。目前,最常用的確定基因突變來源的分析方法是PCR-STR連鎖分析,不過這種方法屬對(duì)基因突變的間接診斷,存在一定的局限性。本研究應(yīng)用PCR-SSCP檢測方法對(duì)PKU患者的家系進(jìn)行分析,以便將來把PCR-SSCP更好地應(yīng)用于PKU產(chǎn)前診斷。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

15例經(jīng)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院新生兒篩查中心確診的經(jīng)典型PKU患者及其雙親作為研究對(duì)象。PKU患者中,男9例,女6例,年齡為1～11歲,平均3.4歲,7例患者為出生后篩查診斷,4例為出生后6個(gè)月～1.5歲獲得診斷,所有PKU患者均經(jīng)低苯丙氨酸飲食治療。無PKU家族史的正常人作為正常對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 DNA制備和PCR擴(kuò)增 提取患者及雙親和正常人的外周血,采用經(jīng)典的酚、氯仿法提取基因組DNA,TE溶解,-20℃?zhèn)溆?。?、5、6,7、11外顯子及旁側(cè)內(nèi)含子擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)[1]由上海生工合成。PCR擴(kuò)增體系：總體積25μL,含1×PCR-Buffer、50mmol/L dNTP、1.5 mmol/L MCl、正、反向引物各10pmol、Taq DNA聚合酶0.25U、基因組DNA100ng。反應(yīng)條件：先95℃變性5min,然后94℃30s,56℃復(fù)性30s,72℃延伸45s,共35個(gè)循環(huán),70℃延伸10min,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 SSCP-非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,銀染分析8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(29∶1;含5%甘油),垂直電泳(膠長16cm),垂直電泳槽于4℃冰箱,預(yù)電泳30 min,PCR產(chǎn)物4uL與等體積SSCP上樣緩沖液(95%甲酰胺,0.5mL 0.5M EDTA,0.05%溴酚藍(lán),0.05%二甲苯晴)混合,97℃變性3min,立即置于冰水混合物中5min,快速上樣,電壓300V,4℃恒溫電泳4～6h。用銀染色法顯示擴(kuò)增DNA區(qū)帶,掃描儀(清華紫光)掃描,分析結(jié)果確定突變基因的來源,并通過PCR正反測序證實(shí)。

2 結(jié)果

15個(gè)PKU家系的PCR-SSCP檢測及PCR測序結(jié)果顯示：15例患者中共檢出10種PAH基因突變總共14個(gè)突變等位基因來源(父或母)均得到確定,突變類型包括錯(cuò)義突變,無義突變,缺失和同義突變等;1例患者(突變基因型為G247V/R243X)的基因突變來源未能通過SSCP方法確定(表1),另有4個(gè)家系未檢測到基因突變。

3 討論

PAH基因內(nèi)含子3中STR的(TCTA)核心序列重復(fù),雖然具有高度多態(tài)性,能夠用于家系連鎖分析,檢出突變基因。對(duì)PKU家系PCR-SSCP分析顯示：此方法在確定PAH基因突變來源方面具有很好的應(yīng)用價(jià)值。從圖1可知,1～3道為G247R雜合突變家系,G247R雜合子患者的正常電泳條帶存在,多了一條異常電泳條帶,母親的異常電泳條帶與患者的一致,說明患者遺傳了母親的一條異常染色體,經(jīng)測序證實(shí)母親為G247R突變攜帶者(圖2：a);4～6道為R243Q突變家系,R243Q純合子患者的一條異常電泳條帶與父親和母親的異常電泳條帶一致,并出現(xiàn)正常條帶的缺失,說明兩個(gè)突變等位基因一個(gè)來源于父親,另一個(gè)來源于母親,經(jīng)測序證實(shí)父母均為R243Q突變基因攜帶者(圖2：b)。由圖1可知,SSCP結(jié)果無正常電泳條帶的缺失,說明為外顯子7的突變雜合子,此結(jié)果也在第3、5、6、11外顯子的SSCP分析中得到驗(yàn)證;若出現(xiàn)正常條帶的缺失,則很可能為突變純合子患者。

1例患者的基因型為G247V/R243X,突變來源未能確定。此患者的SSCP多了一條異常電泳條帶與父親的電泳條帶一致,其母親的電泳條帶與正常電泳條帶無差別,經(jīng)測序證實(shí)父親為R243X突變雜合子,母親為G247V突變雜合子,變換SSCP檢測條件(用不同比例和濃度的凝膠,改變電壓,溫度等),仍然不能確定突變基因來源。原因可能是由于G247V突變DNA鏈與正常DNA鏈的空間構(gòu)像相似,或者雖然空間構(gòu)像不同,其在凝膠電泳時(shí)與正常DNA鏈的遷移速率差異較小。本研究中另1例患者的基因型為R243Q/R261X,2種突變也位于外顯子7,患者的電泳條帶多了2條異常條帶,父母各多了1條異常帶,根據(jù)異常條帶的位置雖不能明確父母攜帶的基因突變類型,但如進(jìn)行產(chǎn)前診斷時(shí)則可給出較明確的結(jié)論。

PCR-SSCP分析方法可以很好地應(yīng)用于判斷PKU患者的基因突變來源,其結(jié)果清晰,容易判斷,如果應(yīng)用于產(chǎn)前基因診斷時(shí),在傳統(tǒng)的STR連鎖分析無能為力時(shí),SSCP分析依然能夠顯示其獨(dú)特的優(yōu)越性：(1)只要患者的突變能夠通過SSCP方法檢測出異常,就可通過此分析方法確定突變的親代來源;(2)能夠區(qū)分雜合與純合突變;(3)能夠在缺少先證者的情況下對(duì)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷。這些優(yōu)點(diǎn)是傳統(tǒng)的STR連鎖分析所不可能達(dá)到的。盡管如此,PCRSSCP應(yīng)用于基因診斷和產(chǎn)前診斷時(shí)也存在不足之處：(1)由于SSCP對(duì)突變檢測敏感性的限制,僅適用于能夠通過SSCP檢測到的突變;(2)由于不同濃度和比例的聚丙烯酰胺凝膠,溫度,電壓等條件對(duì)同一DNA樣本會(huì)造成電泳行為的差異,而且PAH基因突變類型復(fù)雜多樣,不能僅僅根據(jù)突變條帶的位置確定突變類型;(3)對(duì)2個(gè)突變位于同一外顯子的雜合子患者,SSCP分析方法不能很好地判斷突變來源;(4)患者經(jīng)SSCP檢測出的異常后必須要通過測序證實(shí)其為致病突變后才能使用SSCP分析方法進(jìn)行產(chǎn)前診斷,因?yàn)橥x突變(如Q232Q突變)也能造成DNA鏈電泳行為的異常,在應(yīng)用于基因診斷和產(chǎn)前診斷時(shí)應(yīng)特別注意。

表1 PKU家系PCR-SSCP分析結(jié)果

圖1 PAH基因外顯子7的SSCP圖

圖2 PAH基因突變PCR測序圖如下(與圖1相對(duì)應(yīng))

總之,PCR-SSCP是一種能夠用于確定PKU患者基因突變來源和進(jìn)行PKU產(chǎn)前基因診斷較為理想的檢測方法,對(duì)促進(jìn)人類優(yōu)生事業(yè)的發(fā)展具有積極意義。

[1]張志,莊俊漢,黃宗青,等.經(jīng)典型苯丙酮尿癥基因全長外顯子的突變檢測和分析[J].中國優(yōu)生遺傳雜志,2006,14(5):14～21.

[3]Woo SLC, Lidsky A, Law M,et al. Regional mapping of the human phenylalanine hydroxylase gene and PKU locus to 12q21-qter.(Abstract) Am[J].J. Hum. Genet. 1984,36:210S only.