許永春 李兆申 龔燕芳 金晶

左旋鹽酸精氨酸腹腔注射建立輕、重兩種急性胰腺炎模型

許永春 李兆申 龔燕芳 金晶

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是發(fā)生于胰腺的炎癥性疾病，建立合適的動物模型有助于其研究。目前較多采用逆行膽胰管注射法制備急性壞死性胰腺炎(ANP)模型和腹腔注射雨蛙素制備急性水腫性胰腺炎(AEP)模型。本文采用不同濃度的左旋鹽酸精氨酸腹腔注射建立兩種AP模型，現(xiàn)報告如下。

一、材料和方法

1．動物模型制備：健康雄性SD大鼠60只，體重200～250 g，清潔級，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。按數(shù)字表法隨機分為對照組、5%左旋鹽酸精氨酸(5%精氨酸)組和15%精氨酸組，每組20只。左旋鹽酸精氨酸，分析純級，由上海華美生物工程公司提供。實驗前大鼠禁食12 h,自由飲水。精氨酸組大鼠分兩次腹腔注射5%或15%左旋鹽酸精氨酸2.0 mg/g體重，間隔1 h。對照組腹腔注射等容積無菌生理鹽水。注射后6、12、24 h自大鼠股靜脈取血1 ml，分離血清，置-80℃冰箱保存。注射后24 h處死大鼠，取胰腺組織予10%中性甲醛固定。

2．觀察指標(biāo)：(1)觀察大鼠24 h死亡率。(2)采用酶法(麥芽6糖)檢測血淀粉酶；葡萄糖氧化酶法檢測血糖；化學(xué)比色法檢測血鈣；酶法檢測肌酐；速率法檢測GTP。均按HITACHI 7600型全自動生化分析儀(日本)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程操作。(3)固定的胰腺標(biāo)本常規(guī)包埋、制片、HE染色，由專業(yè)的病理醫(yī)師閱片，每張切片觀察20個視野，參考Schmidt等[1]的標(biāo)準(zhǔn)評分。

二、結(jié)果

1．死亡率：24 h后，對照組及5%精氨酸組大鼠無死亡，15%精氨酸組死亡6只，死亡率30%。

2．實驗室檢測指標(biāo)的變化：5%精氨酸組、15%精氨酸組血淀粉酶均較對照組明顯升高(P<0.01)，其中5%精氨酸組升高程度相對較低。5%精氨酸組血糖、血鈣、肌酐及GTP含量與對照組無顯著差異；15%精氨酸組的血糖、肌酐及GTP含量隨時間延長呈上升趨勢，均較對照組顯著升高(P<0.05或P<0.01)，而血鈣含量較對照組顯著降低(P<0.05或P<0.01，表1)。

3．胰腺組織病理學(xué)改變：對照組胰腺外觀正常，鏡下未見異常改變。5%精氨酸組胰腺輕度腫脹；鏡下見腺泡和導(dǎo)管基本正常，未見出血壞死，間質(zhì)水腫明顯，有少至中等量炎細(xì)胞浸潤，水腫及炎細(xì)胞浸潤分值分別為(1.48±0.39)、(1.53±0.41)分。15%精氨酸組大鼠胰腺明顯腫脹，質(zhì)硬，見片狀黃色壞死灶，大網(wǎng)膜、腸系膜上見皂化斑，腹腔有中至大量血性腹水；鏡下見胰腺組織大片出血、凝固性壞死及脂肪壞死，壞死區(qū)內(nèi)大量中性白細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤，血管破裂出血(圖1)，水腫、炎細(xì)胞浸潤、出血以及壞死分值分別為(3.35±1.21)、(3.15±1.28)、(2.60±0.83)和(2.75±1.04)分，與5%精氨酸組比較均有顯著差異(P值均<0.01)。

表1 各組大鼠血清淀粉酶、血糖、血鈣、肌酐和GTP含量的變化

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01

圖1假手術(shù)組(a)、5%精氨酸組(b)、15%精氨酸組(c)胰腺組織病理改變(HE ×200)

討論理想的AP動物模型應(yīng)使其發(fā)病機制與人相似，重復(fù)性好，非侵入性，且簡便、價廉，疾病進(jìn)程、并發(fā)癥、死亡率與人類AP相似，并具有同樣的治療反應(yīng)[2]?，F(xiàn)有的AP動物模型主要包括胰管結(jié)扎法、乙硫氨酸飲食法、逆行胰膽管注射法和促胰液分泌法(包括雨蛙素腹腔注射法)，其中膽胰管注射法由Aho等[3]1980年首創(chuàng)，運用較為廣泛，該模型較接近人類胰管梗阻、膽汁反流等病因形成的急性胰腺炎。這些動物模型尚無一種與人類AP發(fā)病過程完全一致，僅在某些方面有不同程度的相似性，因而根據(jù)不同的研究目的，選擇相應(yīng)的動物模型。

Tani等[4]首次報道腹腔內(nèi)注射過量左旋鹽酸精氨酸建立大鼠AP動物模型,其機制是大劑量左旋鹽酸精氨酸抑制胰腺腺泡細(xì)胞核酸及蛋白質(zhì)合成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和胰腺炎相關(guān)蛋白(pancreatitis-associated protein,PAP)基因的表達(dá),從而抑制胰腺腺泡細(xì)胞增殖，損傷胰腺組織；此外，左旋鹽酸精氨酸注射入動物體內(nèi)后轉(zhuǎn)化形成的NO以及氧自由基、細(xì)胞因子等也參與了胰腺的損傷[5-7]。本文結(jié)果顯示，5%左旋精氨酸組僅能引起一過性血淀粉酶升高，無其他臟器功能改變，病理檢查僅見胰腺組織水腫，炎細(xì)胞浸潤，為AEP的病理表現(xiàn)。注射15%左旋精氨酸有一定的動物死亡率，血淀粉酶、血糖升高，血鈣降低，肝、腎功能損害，病理檢查見胰腺出血壞死，大量炎癥細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)血性腹水，符合ANP的表現(xiàn)，與重癥急性胰腺炎患者胰腺損傷及臟器功能障礙表現(xiàn)相似。

目前常用的十二指腸閉袢法和逆行性膽胰管注射法等AP建模方法需要對動物進(jìn)行手術(shù),操作復(fù)雜,損傷大；腹腔、靜脈注射蛙皮素誘導(dǎo)的AP病變程度輕、費用高；膽堿乙硫胺酸(CDE)膳食誘導(dǎo)的AP死亡率過高,病理變化程度不一致；而本文采用不同濃度的左旋鹽酸精氨酸大鼠腹腔內(nèi)注射建立的輕、重兩種AP模型，不用開腹操作，簡單、省時，費用低廉，并且實驗重復(fù)性好，結(jié)果可靠，適合AP發(fā)病機制和治療學(xué)的研究。

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2010-03-12)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.06.025

全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金資助(08MA064)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院消化科(許永春，現(xiàn)在江西省南昌市解放軍第九四醫(yī)院消化科)

李兆申，Email:zhsli@81890.net