梁明珍,靳興軍,沈光年

(北京市獸醫(yī)實驗診斷所,北京朝陽100101)

鴨是禽流感傳播鏈中的一個重要環(huán)節(jié),能否有效防控鴨禽流感的關(guān)鍵之一是使用科學(xué)的檢測方法。目前,是參照禽流感血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗標(biāo)準(zhǔn)(GB/T18936-2003)[1],但是,鴨體內(nèi)含有非特異性抑制因子,血清中的唾液酸殘基會模擬紅細胞受體,同紅細胞受體競爭與流感病毒血凝素的結(jié)合,因而會導(dǎo)致非特異性抑制結(jié)果(假陽性)的出現(xiàn),用雞紅細胞懸液檢測水禽禽流感血清抗體時,常常存在非特異性凝集現(xiàn)象,出現(xiàn)前帶和后帶現(xiàn)象,有時能嚴(yán)重影響結(jié)果的判定。為此,本文采用不同種家禽的紅細胞懸液做重復(fù)試驗,探討水禽血清的處理方法及不同種的家禽紅細胞懸液對水禽禽流感血清抗體檢測的影響,在臨床應(yīng)用中,可為鴨禽流感免疫技術(shù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF公雞(梅里亞實驗動物中心)紅細胞懸液,非免疫鴨紅細胞懸液,禽流感H5亞型抗原和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所),RDE酶(中國疾病預(yù)防控制中心),96孔90度V型血凝反應(yīng)板,量程為5～50μL單道和八道的精確微量移液器。

1.2 樣品采集 采集北京市郊區(qū)縣蛋、肉用規(guī)模化種場、規(guī)?；唐穲觥⑥r(nóng)村養(yǎng)殖戶鴨。

鴨待檢血清樣品通常選擇腿靜脈采血,每只采血樣2～3mL,經(jīng)2500r/min離心或自然放置析出血清。

1.3 試劑 配制 pH7.0～7.2、0.01mol/LPBS作為稀釋液;阿氏液(Alsevers)作為紅細胞保存液;1%和5%的雞 、鴨紅細胞懸液。

1.4 方法 采用禽流感血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗(按GB/T18936-2003標(biāo)準(zhǔn))[1],《高致病性禽流感和口蹄疫等主要動物疫病免疫方案》(農(nóng)醫(yī)發(fā)[2008]5號),家禽免疫后21d進行免疫效果監(jiān)測。存欄禽群免疫抗體合格率必須≥70%判定合格。禽流感抗體血凝抑制試驗(HI)抗體效價≥4log2為免疫合格,群體免疫抗體合格率必須≥70%判定合格。

2 鴨禽流感免疫抗體HI的判定標(biāo)準(zhǔn)和比較試驗

2.1 方法比較 方法1：鴨血清樣本經(jīng)5%雞紅細胞懸液處理。血清吸附處理方法：在V型血凝反應(yīng)板第1列孔中先加采集的鴨血清樣本50μL,然后再加5%雞紅細胞懸液50μL,振蕩混勻,室溫作用1h后作為待檢鴨血清樣本,按國標(biāo)進行凝集抑制實驗。

方法 2：將待檢鴨血清樣本經(jīng)受體破壞酶(RDE)處理。RDE吸附處理方法：將待檢鴨血清與受體破壞酶按1∶4混合,經(jīng) 37℃水浴過夜,次日56℃滅活50min后,作為待檢鴨血清樣本,按國標(biāo)進行凝集抑制試驗。

方法3：將未經(jīng)任何處理的待檢鴨血清樣本,按國標(biāo)進行凝集抑制試驗,但分別用雞或鴨紅細胞懸液做對比改良試驗。

2.2 試驗結(jié)果 見表1、表2。

從表1和表2可以看出,經(jīng)5%雞紅細胞吸附處理的待檢鴨血清(加上處理時的稀釋度)比未經(jīng)5%雞紅細胞吸附處理后的待檢鴨血清HI效價平均值高0.55;未經(jīng)DEF處理的待檢鴨血清比經(jīng)DEF處理后的待檢鴨血清HI效價(加上處理時的稀釋度)平均值高0.10;加入1%鴨紅細胞懸液比加入1%雞紅細胞懸液的試驗HI效價平均值高0.8。經(jīng)DEF處理后的待檢鴨血清及加入1%鴨紅細胞懸液的HI試驗無非特異性凝集出現(xiàn)。所有試驗標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對照成立。

3 鴨禽流感免疫抗體HI方法的應(yīng)用

將重組禽流感滅活疫苗(H5N1亞型)進行免疫,用HI方法,按表3進行抗體監(jiān)測。

免后21d進行監(jiān)測抗體,HI抗體平均水平小于或者等于4log2時,須加強免疫,以后每個月監(jiān)測抗體1次。通過對283個場戶,種鴨60只,肉鴨223只,1667份樣本監(jiān)測,免疫次數(shù)與免疫抗體效價如圖1,呈明顯正相關(guān)。

3.1 種鴨(蛋鴨) 分析10個區(qū)縣免疫合格率大于70%的場戶的免疫,發(fā)現(xiàn)首免時機集中在3～10日齡,2免時機集中在20～30d后,以后間隔免疫的時間平均為3個月,接種疫苗3次時有70%的場戶合格率達到70%,接種疫苗4次后有85%的場戶合格率達到70%,接種疫苗6次后,98%的場戶達到70%的合格率。

表1 3種方法凝集抑制試驗

表2 HI效價及非特異性凝集比較

表3 禽流感滅活疫苗免疫

圖1 免疫抗體監(jiān)測圖

3.2 肉鴨 分析10個區(qū)縣的15個場戶,發(fā)現(xiàn)首免日齡集中在3～7日齡,約50%的場戶在20日齡前后做了加強免疫。雖然抗體合格率不能達到70%,但通過野毒檢測,沒有感染情況出現(xiàn)。此外,根據(jù)實驗室的試驗,雛鴨的母源抗體一般可維持10～15d。

3.3 小鴨機體對免疫無可見的免疫應(yīng)答,其原因可能是受母源抗體的影響或與小鴨免疫系統(tǒng)尚未成熟有關(guān),由此啟示在鴨禽流感免疫中2周齡的小鴨尤其是生長期短的肉鴨,不能依賴主動免疫而應(yīng)加強種鴨免疫來提高母源抗體水平,使其建立良好的天然被動免疫。

3.4 從臨床觀察鴨經(jīng)禽流感疫苗免疫后無論抗體水平高低,帶毒檢測都為陰性,這種現(xiàn)象提示鴨經(jīng)禽流感疫苗免疫可降低甚至避免鴨群禽流感的帶毒現(xiàn)象。

4 討論

4.1 試驗結(jié)果表明,方法1可降低水禽血清中非特異性凝集因子對檢測的影響,但吸附不完全,方法繁雜,耗時長,不適合大批檢測;方法2可完全去除鴨血清中的非特異性凝集因子,但處理血清的成本高,對大批量檢測過程繁雜,在臨床中不易廣泛使用;方法3中用雞紅細胞懸液檢測鴨血清抗體有非特異性凝集現(xiàn)象,且出現(xiàn)前帶或后帶現(xiàn)象,干擾結(jié)果判定,抗體滴度均值比鴨紅細胞懸液檢測鴨血清抗體均值要低0.8個滴度。方法3中用鴨紅細胞來檢測鴨的禽流感血清抗體,幾乎可完全消除非特異性凝集因子對鴨禽流感抗體檢測的影響,與占松鶴[2]、吳俊華[3]、張評滸[4]等文章的研究結(jié)果一致,更能準(zhǔn)確客觀的反映抗體水平,適合在不增加檢測成本的基礎(chǔ)上大批檢測,筆者認(rèn)為該方法較好。

4.2 目前,控制鴨禽流感的主要手段是借鑒雞的免疫程序形成的免疫監(jiān)測體系。特禽、水禽等禽類接種流感疫苗免疫效力的評價還缺乏足夠的血清學(xué)依據(jù)。是否用同源紅細胞來檢測禽流感疫苗免疫效力評價方面有待于更多的工作和監(jiān)測數(shù)據(jù)予以支持。

4.3 北京市在2005年開始進行對水禽的全面禽流感免疫,我們從免疫抗體主動監(jiān)測的上千份樣本數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn),鴨場按照其規(guī)程免疫過的鴨群中,免疫保護率如果按雞的保護率標(biāo)準(zhǔn)計算,同種類的疫苗在雞的保護率則高達90%以上,而鴨的抗體保護率則低于雞的保護率。

4.4 雞的禽流感免疫監(jiān)測體系不完全適合于鴨,經(jīng)過連續(xù)免疫抗體監(jiān)測試驗及帶毒篩查,證明H5N1亞型禽流感新型疫苗對水禽免疫有可靠效果,雖然鴨等水禽初次接種疫苗后保護率偏低,但多次免疫后免疫應(yīng)答良好,可避免感染和降低病毒的侵害,鴨禽流感抗體血凝方法檢測的應(yīng)用為鴨禽流感防控提供了有價值的數(shù)據(jù)依托。

[1]GB/T18936-2003,高致病性禽流感診斷技術(shù)[S].

[2]占松鶴,劉華.不同家禽紅細胞懸液檢測水禽禽流感抗體對比試驗[J].畜牧與飼料科學(xué),2009,30(5)：11-12.

[3]吳俊華,邱艷紅,葉瑋,等.用鴨紅細胞懸液消除非特異性凝集因子對鴨禽流感 HI試驗的影響[J].養(yǎng)禽與禽病防治,2006(12)：5-6.

[4]張評滸,唐應(yīng)華,仇旭升,等.不同家禽紅細胞懸液對禽流感血清抗體檢測的影響[J].中國獸醫(yī)科技,2005,35(4)：267-271.