邵元龍,董 英

江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013

醬油曲霉發(fā)酵芝麻餅粕發(fā)酵基質(zhì)的優(yōu)化

邵元龍,董 英＊

江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013

采用響應(yīng)面法對(duì)醬油曲霉發(fā)酵芝麻餅粕提高抗氧化能力的發(fā)酵基質(zhì)組成進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò) Plackett-Burman設(shè)計(jì)法,評(píng)價(jià)了麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、麥麩、玉米漿、酵母膏和硫酸銨等 8個(gè)因素對(duì) DPPH自由基清除能力的影響。篩選出麥麩、葡萄糖和硫酸銨為影響芝麻餅粕發(fā)酵提取物抗氧化活性的 3個(gè)顯著因素,然后用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法,對(duì) 3個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行了探討與優(yōu)化。優(yōu)化的發(fā)酵條件為:葡萄糖、硫酸銨和麥麩添加量分別為:1.87%、1.54%和 2.55%。在該試驗(yàn)條件下,DPPH自由基清除率為 80.26%,比未發(fā)酵的芝麻餅粕高37%。

芝麻餅粕;發(fā)酵;優(yōu)化;抗氧化活性;醬油曲霉

國(guó)內(nèi)外對(duì)芝麻餅粕中抗氧化物質(zhì)的研究日趨深入,如對(duì)芝麻素的提取工藝、檢測(cè)方法[3-7]的研究。2003年,日本的Ohtsuki[8]等,用環(huán)狀芽孢桿菌 YUS-2液體發(fā)酵芝麻餅粕,發(fā)現(xiàn)兩種新的具有更強(qiáng)抗氧化能力的物質(zhì)。2005年,日本的 Yoshiaki[9]等采用Aspergillus分別發(fā)酵芝麻素 (Sesamin)和三糖基芝麻素酚 (Sesaminol Triglucoside),轉(zhuǎn)化生成了具有兒茶酚結(jié)構(gòu)的新物質(zhì),并顯示更強(qiáng)的抗氧化活性。2007年,董英[10]用醬油曲霉發(fā)酵芝麻餅粕,發(fā)現(xiàn)可以提高其抗氧化活性,但并未對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。因此,本文仍選用該菌株對(duì)芝麻餅粕進(jìn)行發(fā)酵,以抗氧化活性為指標(biāo),對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化,為對(duì)發(fā)酵芝麻餅粕中抗氧化物質(zhì)的提取,分析和轉(zhuǎn)化機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

菌株:醬油曲霉 (Aspergillus sojae),CICC2128:購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心;芝麻餅粕:江蘇鎮(zhèn)江京友調(diào)味品公司提供;二苯代苦味肼基自由基(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH):美國(guó) Sigma公司。

JJ-1型電動(dòng)攪拌器:江蘇金壇醫(yī)療儀器廠;LD5-10離心機(jī):北京醫(yī)用離心機(jī)廠;WFJ-72000可見分光光度計(jì):尤尼柯 (上海)儀器有限公司;Y M50A電熱蒸汽壓力滅菌器:上海三申醫(yī)療器械有限公司; PSX智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱:寧波來(lái)?？萍加邢薰?。

1.2 發(fā)酵方法

1.2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

醬油曲霉接種于土豆汁 (PDA)斜面培養(yǎng)基上, 28℃培養(yǎng) 72 h后,加入 10 mL無(wú)菌生理鹽水,用接種針刮下,調(diào)節(jié)菌液濃度為 0.86×108cfu/mL。將粉碎的芝麻餅粕在烘箱中烘干,按料液比為 1∶3的比例加入正己烷,45℃水浴攪拌 3 h,4000 r/min離心 10 min,得脫脂芝麻餅粕。取 10 g烘干的脫脂芝麻餅粕加入9 mL溶解有不同成分的溶液,于 121℃滅菌 20 min,冷卻后,接種 1 mL制備好的種子懸液,搖勻,于 28℃條件下發(fā)酵 144 h。

根據(jù) Aspergillus生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)要素的基本原則和發(fā)酵影響因素的一般規(guī)律,結(jié)合相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道和前期的實(shí)驗(yàn),選用試驗(yàn)次數(shù) N=12的試驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)麥芽糖(A)、葡萄糖(B)、蔗糖 (D)、果糖 (E)、麥麩(G)、玉米漿(H)、酵母膏 (K)和硫酸銨 (L)8個(gè)因素進(jìn)行考察,分別對(duì)應(yīng)于表中的 8列,每個(gè)因素取兩個(gè)水平,響應(yīng)值為提取液對(duì)DPPH自由基清除率(RSA%)。另設(shè) 3個(gè)虛擬列,以考察實(shí)驗(yàn)誤差。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,得出各因素的 F值和可信度水平。一般選擇可信度大于 90%以上的因素作為重要因素。實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表 1。

1.提高認(rèn)識(shí)，統(tǒng)一思想，構(gòu)建企業(yè)大黨建工作格局。非公企業(yè)黨組織是黨在企業(yè)中的戰(zhàn)斗堡壘，在企業(yè)職工群眾中發(fā)揮政治核心作用，在企業(yè)發(fā)展中發(fā)揮政治引領(lǐng)作用。明確“兩個(gè)作用”，引導(dǎo)社會(huì)各界認(rèn)同和重視非公企業(yè)黨建工作，探索建立在黨委和組織部門領(lǐng)導(dǎo)下的各部門分工協(xié)作工作機(jī)制，構(gòu)建企業(yè)大黨建工作格局。

表 1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平Table 1 Levels of independent variable in Plackett-Burman design

1.2.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析表明,醬油曲霉固體發(fā)酵芝麻餅粕提取物的 RSA影響顯著的外界因子為葡萄糖 (P<0.05)、硫酸銨 (P<0.01)和麥麩(P<0.05)。試驗(yàn)中響應(yīng)值為DPPH自由基清除率(RSA%),試驗(yàn)因素隨機(jī)編碼為:葡萄糖 (X1)、硫酸銨(X2)和麥麩(X3),試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)如表2所示,發(fā)酵條件與 Plackett-Burman試驗(yàn)一致。

表 2 Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平Table 2 Levels of independent variable in Box-Behnken design

1.3 提取方法

發(fā)酵結(jié)束后,每瓶加入 80%乙醇 75 mL,50℃水浴攪拌提取 2 h,轉(zhuǎn)速 150 r/min。上清液于 5000 r/min離心 10 min。沉淀按同樣條件重復(fù)提取一次,合并上清液,定容至 150 mL。

1.4 DPPH自由基清除率測(cè)定 (Radical Scavenging Activity,RSA)

取發(fā)酵提取液 1 mL,用 50%的乙醇稀釋 10倍,作為樣品液。DPPH溶液濃度為 7.5×10-6mol/mL,波長(zhǎng) 517 nm,50%乙醇為對(duì)照。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定兩次,求平均值。

計(jì)算公式為:

式中:A0—5 mL DPPH與 1 mL乙醇混合液的吸光度;Ai—5 mL DPPH與1 mL樣品反應(yīng)后的吸光度;Aj—5 mL乙醇與 1 mL樣品混合液的吸光度[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

Plackett-Burman設(shè)計(jì)法是一種兩水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,它基于非完全平衡塊原理,可以用最少試驗(yàn)次數(shù)估計(jì)出因素的主效應(yīng),適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素,供進(jìn)一步研究用。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,得出各因素的F值和可信度水平。一般選擇可信度大于 90%以上的因素作為重要因素[12]。Plackett-Bur man試驗(yàn) 設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表 3。

表 3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design matrix and exper imental results of Plackett-Burman

由表 4各因素效應(yīng)分析結(jié)果可知,經(jīng)過(guò)菌株Aspergillus發(fā)酵后,葡萄糖、麥麩和硫酸銨三個(gè)因素對(duì)提取液清除 DPPH自由基影響顯著,可信度在90%以上,對(duì)此三因素進(jìn)一步做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。而其他因素的取值則根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)和大小,正效應(yīng)的因素均取較高值,負(fù)效應(yīng)的因素均取較低值。

表 4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果相關(guān)系數(shù)和方差分析結(jié)果Table 4 Regression coefficients and variance analysis for the Plackett-Burman design result

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

Box-Behnken優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表 5,利用Desig-Expert 7.0軟件,對(duì)表 5中數(shù)據(jù)回歸擬合,獲得Aspergillus發(fā)酵芝麻餅粕的提取物抗氧化能力對(duì)自變量葡萄糖、硫酸銨和麥麩的二次多項(xiàng)回歸方程:

表 5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design matrix and experimental results ofBox-Behnken

-1 0 -1 7 0 . 2 6 6 1 0 -1 7 5 . 5 4 5 -1 0 1 7 2 . 4 6 8 1 0 1 7 9 . 6 4 7 -1 -1 6 9 . 8 5 1 0 0 1 -1 7 1 . 2 1 1 0 -1 1 7 5 . 1 4 1 2 0 1 1 7 7 . 7 5 1 3 0 0 0 7 8 . 7 9 1 4 0 0 0 7 8 . 2 6 1 5 0 0 0 7 7 . 8 8 9 0

模型方差分析見表 6,試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性 (P=0.0229),失擬項(xiàng)不顯著 (P=0.0569),其校正系數(shù) R2=0.926,表明有約92.6%的抗氧化能力能由此模型進(jìn)行解釋。所以自由基清除率與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合優(yōu)度,可用于 Aspergillus固體發(fā)酵提高抗氧化能力的分析和預(yù)測(cè)。表 6中,3個(gè)試驗(yàn)因素中 X1和 X3對(duì)發(fā)酵提取物清除DPPH自由基能力的影響極顯著。硫酸銨和因素的交互作用影響皆不顯著。

表 6 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 6 Analysis of variance for the Box-Behnken design result

2.3 模型驗(yàn)證

表7 模型驗(yàn)證Table 7 Model verification

?

為驗(yàn)證Aspergillus固體發(fā)酵提高抗氧化能力模型方程的合適性和有效性,在葡萄糖、硫酸銨和麥麩試驗(yàn)水平范圍內(nèi),選擇性地進(jìn)行了 5組不同組合的實(shí)際驗(yàn)證試驗(yàn) (表 7),同時(shí)設(shè)兩組未添加任何營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的芝麻餅粕作為對(duì)照。利用 SPSS(version 14.0)軟件對(duì)表 7中數(shù)據(jù)進(jìn)行距離相關(guān)分析得知,自由基清除率實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)系數(shù) r為0.865,證明此模型是合適有效的,并具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。選擇 1號(hào)驗(yàn)證試驗(yàn)的因素組合作為優(yōu)化的結(jié)果,即葡萄糖:X1=1.87%、硫酸銨:X2= 1.54%、麥麩:X3=2.55%,該條件下,芝麻餅粕發(fā)酵提取物清除 DPPH自由基活性為 80.26%,與未發(fā)酵的芝麻餅粕相比,活性提高 37%。

3 結(jié)論

3.1 用 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì),篩選出影響芝麻餅粕發(fā)酵提取物抗氧化活性的關(guān)鍵因素由強(qiáng)到弱的順序?yàn)辂滬?、葡萄糖和硫酸銨。在試驗(yàn)因素水平范圍內(nèi),清除DPPH自由基能力隨含量的提高而增大。3.2 用 Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化 Aspergillus固體發(fā)酵芝麻餅粕提高抗氧化能力的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型方程為:RSA%=78.31+2.22 X1+0.84 X2+2.27 X3-0.39 X1X2+0.48 X1X3+0.32 X2X3-1.77-2.76-2.06,且該方程的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值相關(guān)系數(shù) r為 0.865,符合程度高,具有一定的指導(dǎo)意義。根據(jù)方程優(yōu)化的參數(shù),獲得較優(yōu)的發(fā)酵條件為:葡萄糖、硫酸銨和麥麩添加量分別為:1.87%、1.54%和 2.55%,在該條件下發(fā)酵,DPPH自由基清除率為 80.26%,比未添加營(yíng)養(yǎng)物的芝麻餅粕高37%。

通過(guò)該優(yōu)化試驗(yàn),為進(jìn)一步對(duì)發(fā)酵餅粕中抗氧化物質(zhì)提取工藝優(yōu)化、組分分析,以及發(fā)酵機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

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Optim ization the Substrate of Sesame Cake Fermentation byAspergillus

SHAO Yuan-long,DONG Ying＊
School of Food and B iological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China

Response surface methodology was used to optimize the substrate composition of improving the antioxidant activity in solid-state fermentation sesame cake byAspergillus sojae.The effects of maltose,glucose,sucrose,fructose, wheat bran,corn steep,yeast extract,and ammonium sulfate onDPPH radical scavening activitywere evaluated by Plackett-Burman design.The results showed that wheat bran,glucose,and ammonium sulfate were the main affecting factors and had significante effects on antioxidant activities.Then,the central composite design and response surface analysis were used to deter mine the optimal levels of the main factors.The optimized fer mentation conditions were as follows:amount of glucose,ammonium sulfate and wheat bran were 1.87%,1.54%,and 2.55%,respectively.Under this condition,the DPPH radical scavening abilitywas 80.26%,which is higher 37%than that of control.

sesame cake;fermentation;optimization;antioxidant activity;Aspergillus sojae

1001-6880(2010)06-1088-05

2008-12-15 接受日期:2009-04-09基金項(xiàng)目:江蘇省科技攻關(guān)項(xiàng)目(BE2005335)

＊通訊作者 E-mail:ydong@ujs.edu.cn

TS.201;Q939.97

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