宋 蕓， 魏紹川,， 王永峰， 焦淑清

(1. 天津天士力集團研究院 化學藥物研究所，天津 300402；2. 佳木斯大學 化學與藥學院 黑龍江省生物藥制劑重點實驗室，黑龍江 佳木斯 154007)

瑞林類藥物的母體是促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing Hormone,簡稱GnRH)，亦稱黃體生成素釋放激素(Luteinizing Hormone-releasing Hormone,簡稱LH-RH )，是由下丘腦脈沖式分泌的十肽激素，其氨基酸序列為：焦谷氨酸(pGlu)-組氨酸(His)-色氨酸(Trp)-絲氨酸(Ser)-酪氨酸(Tyr)-甘氨酸(Gly)-亮氨酸(Leu)-精氨酸(Arg)-脯氨酸(Pro)-甘氨酸(Gly)-氨基。將母體GnRH的6-位和10-位Gly進行構(gòu)型轉(zhuǎn)換和殘基置換，得到了一系列GnRH激動劑，即具有重要臨床價值的瑞林類寡肽藥物，通式為pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y，其氨基酸序列與構(gòu)型見表1。

瑞林類藥物屬于寡肽類化合物，具有易于吸收、生物利用度高、生物活性強且對人體無毒副作用等諸多優(yōu)點，臨床在治療前列腺癌、乳腺癌、子宮肌瘤、青春性早熟、子宮內(nèi)膜異位癥和功能性子宮出血等一些激素依賴性疾病[1]上有著顯著療效，其價格昂貴，市場前景非常廣闊。巨大的經(jīng)濟效益刺激著人們對其合成方法的研究和不斷完善。目前，多肽的合成方法主要包括液相合成、固相合成以及液-固聯(lián)用合成，本文簡要介紹這幾種方法在瑞林類寡肽藥物合成中的應用。

表 1 瑞林藥物的氨基酸序列及構(gòu)型Table 1 Sequence and configuration of amino acids in Relin drugs

1 液相合成

液相多肽合成是在溶液中進行的化學合成方法，因其每步中間產(chǎn)物都可以純化、可以隨意進行非氨基酸修飾并避免氨基酸缺失等優(yōu)點而成為短肽合成的首選方法。采用液相合成法已經(jīng)成功合成了多個瑞林藥物。

1.1 氨基、羧基及側(cè)鏈官能團的保護

氨基酸作為肽合成的基本單元，含有氨基、羧基及某些活潑的側(cè)鏈基團，為確保反應定向進行及減少副反應的發(fā)生，不參與反應的活性基團在接肽反應時必須處于被保護狀態(tài)。以戈舍瑞林(1， Chart 1)為例，合成中所用到的氨基酸有pGlu, His, Trp, Ser, Tyr, D-Ser, Leu, Arg及Pro，文獻中對這些氨基酸的氨基、羧基及活潑側(cè)鏈的保護如表2所示。

1.2 短肽片段的合成

氨基酸的活性基團進行保護后，前一個氨基酸分子裸露的羧基和下一個氨基酸分子裸露的氨基在溶液中可以定向形成酰胺鍵。文獻所用到的瑞林藥物的接肽方法主要有碳二亞胺法、混合酸酐法、活化酯法和疊氮物法。這幾種方法經(jīng)常交叉混合使用于同一個瑞林藥物不同短肽片段的合成中。下面僅以二肽 pGlu-His 的合成為例簡要介紹這幾種方法的具體操作。

(1) 碳二亞胺法[4]： 將pGlu和His-OMe·2HCl懸浮在DMF中，攪拌下于-5 ℃加入三乙胺和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，反應2 h后室溫反應過夜得保護二肽pGlu-His-OMe。

(2) 混合酸酐法[11]： 將Z-pGlu溶解在THF中，冷卻至-20 ℃時加入N-甲基嗎啉(NMM)和氯甲酸異丁酯，攪拌反應1 min得混合酸酐，加N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)反應30 min后再加入His-OH·HCl和三乙胺的水溶液，于0 ℃反應1 h后室溫反應過夜得保護二肽Z-pGlu-His。

(3) 活化酯法[2]： 將等摩爾的His-OH·HCl和Na2CO3溶解在水和DMF的混合溶劑中，攪拌下于室溫加入Z-pGlu-ONB的二氧六環(huán)溶液，反應14 h得保護二肽Z-pGlu-His。

(4) 疊氮物法[10]： 均以氨基酸酯或肽羧酸酯為起始原料。pGlu-His-OMe和99%水合肼溶解在甲醇中，攪拌下于10 ℃反應1 h后室溫反應過夜得pGlu-His-NHNH2。 0 ℃將其溶解在干燥的 DMF和DMSO的混合溶劑中，加入無水HCl的THF溶液。冷卻至-20 ℃時加入亞硝酸異戊酯，反應30 min后再冷卻至-24 ℃，緩慢滴加三乙胺調(diào)節(jié)體系的pH 8～9。于-20 ℃加入Trp-OBzl的干燥DMF溶液，反應30 min后于0 ℃反應18 h得保護三肽pGlu-His-Trp-OBzl。

1.3 保護基的脫除

通過以上方法得到的保護短肽片段，只有脫除氨基或羧基保護基后，才能和另一個氨基酸或短肽片段進行下一步接肽反應以增長肽鏈。從表2可以看出，瑞林類寡肽原料藥的合成所用到的氨基保護基主要是芐氧羰基(Cbz)和叔丁氧羰基(Boc)。其中包含有Arg(NO2或Tos)的肽片段，如果需要保持側(cè)鏈保護基，則用HBr/AcOH體系處理以脫去Cbz[6,15,16]，而其余氨基酸的Cbz則用5%Pd/C催化氫化脫除。Boc-Arg[8]保護基的脫除是在室溫下用3 mol·L-1HCl在乙酸乙酯中反應，其余Boc的脫除則在冰浴下用少量三氟乙酸處理[4]。

對于羧基保護基的脫除，His(Bzl)-OBzl[3]和Trp-OBzl[9,10]中芐酯保護基采用5%Pd/C催化氫化進行；除Arg(NO2)-OMe[14]之外，其余肽甲酯的脫除則用1 mol·L-1NaOH室溫進行皂化[5,7,13]；而大部分羧基保護基則在水合肼、HCl 和亞硝酸異戊酯等的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榀B氮化物[4,6,8,9,11～14]，而后

用于下一步接肽反應。

瑞林類寡肽的合成所用到的側(cè)鏈保護基的脫除大都采用催化還原法，如 His(Bzl)[3]， Tyr(Bzl)[8,14]和Arg(NO2)[8,11]的側(cè)鏈保護基均采用Pd/C催化氫化脫除，而Arg(Cbz2)[14]則采用Pd/BaSO4在甲醇中催化氫化脫除側(cè)鏈保護基。Arg(Tos)[11]中側(cè)鏈保護基Tos則用HF/苯甲醚體系脫除。

需要指出的是，側(cè)鏈保護基與α-氨基保護基的選擇必須符合正交保護策略，即α-氨基保護基的脫除條件要盡量遠離脫除側(cè)保護的條件，以便在肽鏈縮合的過程中保持側(cè)鏈保護基的完整性。

1.4 瑞林類寡肽藥物的合成

將氨基酸的活性基團進行合理保護后，可以通過溶液中的逐個增長肽鏈法和片段縮合法合成瑞林類寡肽藥物。

逐個增長肽鏈法[18]： 從肽鏈的羧端氨基酸Gly開始，依次和Boc或Cbz保護氨基酸在DCC作用下逐步向氨端增長肽鏈，直至側(cè)鏈保護的戈那瑞林的生成。

Chart1

表 2 合成戈舍瑞林所用氨基酸活性基團的保護*Table 2 Protection of active groups of amino acids in the synthesis of goserelin

*-：無保護基； Cbz：芐氧羰基； Boc： 叔丁氧羰基； Bzl： 芐基； Tos: 對甲苯磺?；? Trt: 三苯甲基； Mtr: 4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺?；?/p>

片斷縮合法： 是指在溶液中將幾個預先合成的短肽片斷連接起來。文獻報道的片段縮合方式主要有2+8[19]， 3+7[14,20]， 4+6[8,17,21,22]， 5+5[7,23,24]以及6+3[25]。其中一個典型的4+6[17]片段縮合合成戈舍瑞林的路線如Scheme 1所示。

首先液相合成保護二肽pGlu-His-OMe和Trp-Ser-OMe及保護三肽Cbz-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-OMe和Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH2，然后分別采用疊氮物法合成保護的四肽(2+2)及六肽(3+3)片段。脫除六肽的氨基保護基及精氨酸側(cè)鏈胍基保護基后和四肽片段重復采用疊氮物法合成十肽戈舍瑞林。需要指出的是，除本例采用的疊氮物法外，碳二亞胺法、混合酸酐法和活化酯法也適用于片段縮合合成瑞林化合物。

在液相合成瑞林藥物的過程中，每次接肽反應后都需要對產(chǎn)物進行分離純化以除去未反應的原料和副產(chǎn)物，步驟冗長且麻煩，因操作帶來的損失也很大。早在1971年，A V Schally等[27]采用固相方法合成了第一個GnRH 類似物，由于此方法使多肽合成實現(xiàn)了自動化，只在最后一步進行分離純化，省時省力，基于其優(yōu)點固相肽合成也已經(jīng)廣泛應用于瑞林類寡肽藥物的合成中。

pGlu-His-OMe+Trp-Ser-OMe Cbz-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-N3(3)+Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH2(3)

pGlu-His-Trp-Ser-OMe(4) Cbz-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH2

pGlu-His-Trp-Ser-N3+ Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2·HCl

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2(1)

Scheme1

Scheme2

2 固相合成法

固相肽合成的反應過程如Scheme 2所示。先將所要合成肽鏈的末端氨基酸的羧基共價鍵合到一個不溶性的高分子樹脂上，然后脫去此氨基酸的氨基保護基，以此為氨基組分同過量的活化羧基組分反應以接長肽鏈。這樣的步驟重復多次至目標肽的生成，即縮合→洗滌→去保護→中和、洗滌→下一輪縮合。根據(jù)α-氨基保護基的不同，目前合成瑞林類寡肽藥物的固相方法主要分為Boc法，F(xiàn)moc(芴甲氧羰基)法以及兩者的結(jié)合，下面對這三種方法所用到的固相載體、縮合方法，α-氨基以及側(cè)鏈保護基及脫保護基的條件、肽從樹脂上脫除方法等方面進行總結(jié)。

2.1 Boc法

Boc法是指所有參與反應的氨基酸其α-氨基均采用Boc進行保護，其羧基活化后(已報道的瑞林類寡肽的Boc法固相合成，羧基均采用DCC活化)與樹脂末端裸露的氨基組分進行接肽反應。每一步接肽反應完成后，在中強酸作用下脫除Boc保護基，使α-氨基裸露出來以便進行下一步接肽反應。

為了確保反應的定向進行及減少副反應，活潑的側(cè)鏈基團必須進行保護。側(cè)鏈保護基的選擇原則仍需符合正交保護策略，即其脫除條件必須遠離脫除Boc的中強酸條件，以便在肽鏈形成的過程中保持側(cè)鏈保護的完整性。表3列出了文獻報道的瑞林類寡肽藥物固相Boc法合成中所用的樹脂、脫Boc條件、側(cè)鏈保護基及其脫除方法以及寡肽從樹脂上的切割方法等。從表3可以看出，固相合成瑞林類寡肽藥物中，Boc的脫除均采用了三氟乙酸(TFA)/二氯甲烷(DCM)和1 mol·L-1HCl/AcOH的中強酸條件。肽鏈從二苯甲胺樹脂上切割采用了HF/苯甲醚體系的酸裂解法，從聚苯乙烯/二乙烯基苯交聯(lián)樹脂和氯甲基樹脂上的切割則采用了氨解的方法。接肽反應完成后，所有的側(cè)鏈保護基的脫除和肽鏈的切割同時進行或者切割后一步脫除。

表 3 固相Boc法合成瑞林類寡肽藥物 Table 3 Solid phase Boc methods for the synthesis of Relin drugs

a． 和肽鏈從樹脂上脫除時一起脫掉； b． 用HF在苯甲醚(20%)中脫去(0 ℃)； c． 氨解； d. 1 mol·L-1

表 4 固相Fmoc法合成瑞林類寡肽藥物Table 4 Solid phase Fmoc methods for the synthesis of Relin drugs

a．V(TFA) ∶V(DCM)=2 ∶98; b． TFA/TIS/H2O/EDT溶液，室溫反應2 h; c． 5%Pd/C； d. AcOH/TFE/DCM

以文獻[34]方法為例說明固相Boc法合成曲普瑞林的實驗過程：將二苯甲胺樹脂放在反應器中，按如下順序洗滌：(a)DCM； (b)33%TFA/DCM洗兩次； (c)DCM； (d)乙醇； (e)氯仿； (f)10%TFA/氯仿洗兩次，每次25 min； (g)氯仿； (h)DCM。洗過的樹脂和Boc-Gly在二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)作用下于DCM中室溫反應2 h，而后用DCM，乙醇和DCM分別洗樹脂三次。再用33%TFA/DCM體系脫保護，而后重復c～h洗滌步驟。采用如上相同的方法依次連接下面的氨基酸：Boc-Pro； Boc-Arg(Tos)； Boc-Leu； Boc-D-Trp； Boc-Tyr(2-Br-Cbz)； Boc-Ser(Bzl)； Boc-Trp； Boc-His(Tos)和pGlu。所得到的十肽-樹脂用DCM和甲醇分別洗三次，減壓干燥；于20%的HF/苯甲醚中0 ℃反應30 min，肽鏈從樹脂上脫落的同時側(cè)鏈保護基全部脫除，分離純化得曲普瑞林。

2.2 Fmoc法

所有參與反應的氨基酸，其α-氨基均采用Fmoc進行保護，其羧基活化后與樹脂末端裸露的氨基組分進行接肽反應。每一步接肽反應完成后，F(xiàn)moc均采用20%的哌啶/DMF進行脫除。為確保肽鏈形成過程中側(cè)鏈保護的完整性，側(cè)鏈保護基的脫除條件也必須遠離脫除Fmoc的堿性條件。表4列出了文獻報道的瑞林類寡肽藥物固相Fmoc法合成中所用的樹脂、接肽條件、側(cè)鏈保護基及其脫除方法以及寡肽從樹脂上的切割方法等。從表4 可以看出，F(xiàn)moc固相合成瑞林藥物，接肽反應采用了RCO2Bt活化酯中間體，肽鏈從樹脂上的切割均采用酸裂解方式。接肽反應完成后，所有的側(cè)鏈保護基的脫除和肽鏈的切割同時進行或者切割后一步脫除。

2.3 Boc和Fmoc聯(lián)用法

C F Hayward[40]采用了Boc和Fmoc聯(lián)用法成功合成了1。首先將Boc-Pro連接到聚苯乙烯/二乙烯基苯交聯(lián)樹脂上，用45%TFA/DCM溶液脫Boc保護基，同時采用HOBt和DIPC(二異丙基亞胺)在DMF中將Boc-Arg(HCl)-OH和Boc-Leu-OH的羧基活化為苯并三唑酯，然后依次和脫Boc保護基后的氨基進行接肽反應得到Boc-Leu-Arg(HCl)-Pro-樹脂。其余氨基酸的α-氨基采用Fmoc保護，其羧基用HOBt活化，然后按如下順序Fmoc-D-Ser(But)-OH， Fmoc-Tyr(BrCbz)-OH， Fmoc-Ser-OH， Fmoc-Trp-OH， Fmoc-His(Fmoc)-OH， pGlu-OH依次連接到肽-樹脂上。其中Fmoc保護基的脫除采用20%哌啶/DMF溶液。所得到的九肽-樹脂和20倍過量的無水肼/DMF室溫反應24 h可使肽從樹脂脫落，并同時除去Tyr的側(cè)鏈保護基Br-Cbz，得九肽pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHNH2，再和氰酸鉀在水/乙酸的混合溶劑中反應得到終產(chǎn)物1。

E Nicolás等[41]還采用類Merrifield樹脂從碳端開始前四個氨基酸[Pro， Arg(Mtr)， Leu和D-Leu]采用Boc法，后四個氨基酸[Tyr(But)， Ser(But)， Trp和His(Trt)]采用Fmoc法依次連接，最后和pGlu連接后使用乙胺液體從樹脂上切割下來得亮丙瑞林。

3 液-固聯(lián)用法

無論是單用液相還是固相合成寡肽藥物，均存在著方法上的缺陷。液相合成步驟繁瑣冗長，耗時費力，而固相合成需使用大量的洗脫溶劑，最后的分離純化困難。因此發(fā)展了液-固聯(lián)用法，并且此方法也已經(jīng)成功應用于瑞林類寡肽藥物的合成中。

其中一個成功的例子是內(nèi)源性戈那瑞林的合成[42]。先采用Boc固相合成法將Boc-Gly， Boc-Pro， Boc-Arg(NO2)和Boc-Leu在2,2′-聯(lián)吡啶二硫化物和三苯基磷作用下依次連接到羥甲基樹脂上，得四肽Boc-Leu-Arg(NO2)-Pro-Gly-樹脂。同時采用傳統(tǒng)的液相合成法合成短肽片段Boc-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Gly-OH和Boc-His(Tos)-Trp-OH，再采用固相接肽法依次將這兩個短肽片段連接到四肽-樹脂上得側(cè)鏈保護的九肽-樹脂。用 Na/液氨除去所有的側(cè)鏈保護基，再用HF/苯甲醚將九肽從樹脂上切割下來后，同羧基活化的pGlu-OPcp液相反應得戈那瑞林。該文另一種液-固聯(lián)用法合成戈那瑞林是先將Glu連接到氯甲基甲酰化樹脂上，同時采用液相法合成短肽片段H-His-Trp-Ser(But)-Tyr-Gly-OBut和H-Leu-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2。樹脂-Glu-OBut和三倍量的短肽片段在2,2′-聯(lián)吡啶二硫化物和三苯基磷作用下進行固相片段接肽合成樹脂-十肽，用HF/苯甲醚將肽從樹脂上切割下來并脫除側(cè)鏈保護基后，Glu環(huán)化即得到戈那瑞林。

最近，上海吉爾生化的朱琦等[43]以Arg(pbf)-Trt(2-Cl)-Cl樹脂為起始原料，在 DIC(1 eq)和HOBt作用下在DMF溶液中將Fmoc保護氨基酸依次連接，得全保護八肽pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(But)-Tyr(But)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-樹脂，再用1%的TFA/DCM溶液將肽鏈切割下來。同時，Boc-Pro在THF中和NMM，氯甲酸乙酯及乙胺反應，經(jīng)2 mol·L-1HCl/二氧六環(huán)脫Boc得H-Pro-NHEt·HCl，而后和全保護八肽在DMF中，在HOBt和NMM或DIEA及DIC或BOP作用下生成側(cè)鏈保護的九肽，一步脫除側(cè)鏈保護基得到亮丙瑞林粗品。

4 結(jié)束語

目前，國內(nèi)對GnRH類似物的年需求量在50 kg左右，并以15%的年增長率增長。由于受合成技術(shù)的限制，幾種具有廣闊市場前景的瑞林原料藥在國內(nèi)尚不能夠進行規(guī)模化生產(chǎn)，用于制劑研究的原料藥需要進口，這極大制約了瑞林類藥品的國產(chǎn)化。瑞林藥物90%以上的市場由外資企業(yè)所控制，中國產(chǎn)品幾乎為零，所以該類藥品價格昂貴。鑒于此，本文在查閱大量文獻的基礎上，對瑞林類藥物已有的合成方法進行了歸納總結(jié)，希望以此推動瑞林類原料藥在國內(nèi)早日實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。

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