霍佳平， 司士輝， 王顏紅， 張 紅， 王世成， 林桂鳳

(1． 中南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長沙 410083； 2． 中國科學(xué)院 沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽 110015)

莠去津(1)屬三嗪類除草劑，至今仍在玉米和谷物的種植中被廣泛使用，為環(huán)境荷爾蒙的可疑物質(zhì)[1]。目前對1的檢測主要以色譜法為主[2,3]，由于1通常以痕量形式存在于較為復(fù)雜的樣品中，檢測前處理程序較繁瑣，背景值偏高。因此，探索一種識別性強、干擾小的富集方法具有十分重要的意義。

分子印跡聚合物(MIPs)已廣泛應(yīng)用到了藥學(xué)[4]、食品科學(xué)[5]和環(huán)境學(xué)科[6]等領(lǐng)域，通過目標(biāo)分子與功能分子在交聯(lián)劑作用下引發(fā)聚合，洗脫去目標(biāo)分子后而形成印跡高聚物。劉偉等[7]以喹諾酮類抗菌藥氟哌酸為模板分子，利用本體聚合方法制備了具有特異選擇性的氟哌酸分子印跡聚合物，并利用聚砜與氟哌酸分子印跡聚合物共混的方法制備了分子印跡聚合物膜，取得了較好的選擇性。朱秋勁等[8]利用分子印跡技術(shù)研究了食品中的β-雌二醇人工抗體，低溫紫外引發(fā)聚合與熱聚合對照比較,印跡因子達到1.723。 Bérengère Claude等[9]通過分子印跡膜從植物中對三萜酸進行了選擇性的固相萃取研究，萃取率達到98%?；谄湓砩系膬?yōu)勢，分子印跡以其識別性、專一性等特點可對1進行富集和分離，有較好的實用價值。

本文以1模板分子，甲基丙烯酸(MAA)為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)為交聯(lián)劑，在偶氮二異丁腈(AIBN)的引發(fā)作用下，于65 ℃聚合17 h合成了對1有特異識別性能的分子印跡聚合物(2)。用紫外分光光度法探索了1與MAA的最佳比例，研究了2的吸附性能力，并利用高效液相色譜法對2的選擇性進行了考察。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

UV-2102C型紫外可見分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司)； Waters 600-2487型高效液相色譜(HPLC)儀；ASE-12固相萃取儀(天津奧特賽思儀器有限公司)。

1， 97%原藥，浙江長興中山第一化工有限責(zé)任公司；AIBN，化學(xué)純，天津博迪化工有限公司；MAA，分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；EDMA， 98%，上海晶純試劑有限公司；甲醇、冰乙酸、丙酮等，分析純，天津博迪化工有限公司；甲醇，色譜純，天津市康科德科技有限公司；西瑪津，97%原藥，浙江中興化工輕工有限責(zé)任公司；二次蒸餾水。

1．2 2的合成

在10 mL硬質(zhì)試管中加入MAA 154μL， 1 80 mg及甲苯(1．28 mL)，超聲混勻使其溶解后加入EDMA 3.04 mL和AIBN 6.96 mg，超聲混合均勻，N2吹10 min(除去溶解氧)后密封，于65 ℃聚合17 h得棒狀聚合物。用研缽磨碎，過400目篩，用混合溶劑[V(甲醇) ∶V(乙酸)=9 ∶1]洗至紫外檢測不到1。繼續(xù)用甲醇索式抽提洗至中性，用丙酮反復(fù)沉降三次以上，除去懸浮粉末得2，于50 ℃真空干燥至恒重備用。

不加1，其余反應(yīng)條件同上制得空白聚合物2′。

1.3 MAA用量的選擇

配制c(1)為2×10-5mol·L-1的甲醇溶液，分別以不同比例逐漸增加MAA的用量，用紫外分光光度法記錄其波長掃描的結(jié)果。

1．4 2的結(jié)合能力測定

取2 20.0 mg置于10 mL具塞三角瓶中，加入不同c(1)的甲醇溶液1 mL，振蕩16 h后轉(zhuǎn)移至離心管中離心。取適量上清液測定1的濃度，結(jié)合前后c(1)的變化計算2對1的結(jié)合量(Q)。

1．5 1的吸附選擇性能研究

將干燥的2 20.0 mg置于具塞三角瓶中，加入相同濃度1與西瑪津的混合甲醇溶液1 mL，室溫下振蕩16 h后離心，取上層清液在HPLC上檢測各組分的濃度。

1.6 分子印跡固相萃取柱的應(yīng)用

取2 50 mg干法裝柱制得固相萃取柱。分別用甲苯、甲醇和純水潤洗，將c(1)=2×10-8mol·L-1的水溶液100 mL以1 mL·min-1的流速過柱，1用甲醇洗脫。洗脫液用N2吹干并重新定容，用HCLP檢測，三個平行樣品。

2 結(jié)果與討論

2．1 1與MAA的作用機理

1與MAA以非共價作用力相結(jié)合(Scheme 1)。 1分子中的乙氨基和異丙氨基上與N相連的氫離子與MAA形成氫鍵，形成的具有可逆特性的高聚物，在洗脫后可將分子的結(jié)構(gòu)形成印跡。 反應(yīng)中，甲苯既作為溶劑又作為致孔劑，在交聯(lián)劑EDMA和引發(fā)劑AIBN存在的條件下，2以網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。運用化學(xué)方法洗脫去1，可以形成具有特殊空穴的支架結(jié)構(gòu)。這種特殊空穴具有記憶能力，存在與目標(biāo)化合物的特異性吸附作用。

Scheme 1

2.2 MAA的最佳比例

選擇MAA為功能單體，按不同比例添加MAA至c(1)=2×10-5mol·L-1的甲醇溶液中，UV分析結(jié)果(圖1)顯示，MAA與1之間的作用使吸光度一定程度地增大。理論上MAA濃度的增加可使1與其之間的作用更加充分，然而，大大過量的未參與組裝的MAA可能在空間位阻上阻礙1與功能單體組裝的進行；與此同時， MAA濃度過大也可能引起自身分子間的締合作用，結(jié)果令選擇性結(jié)合位點數(shù)反而降低[4]。因此，隨著1與MAA的比例不斷減小，吸收值在最大吸收波長處呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在1/MAA=1/4時，獲得最優(yōu)的作用效果。

λ/nm圖1 1與MAA的作用曲線Figure 1 Effect plot between 1 and MAA

2．3 2對1的結(jié)合能力

用方法1．4測定1濃度變化時2對1的結(jié)合量，在波長220 nm處用HPLC測試平衡吸附液中1的濃度(圖2)。測試濃度從2×10-7mol·L-1到4×10-5mol·L-1不斷增大，2對1的結(jié)合量也從0.01μmol到0.532μmol增大，當(dāng)濃度增大到一定程度，2的結(jié)合量的增大趨勢變小，基本接近飽和,而2′在結(jié)合量上變化不大，很快趨于飽和。對于相同濃度的1的甲醇溶液，2的吸附量均明顯大于2′，充分表明2的特異性空間結(jié)構(gòu)的存在。2包含有固定空穴，其大小和官能團的排列都與1相匹配，因而選擇性高，吸附能力強；2′對1的吸附主要是非特異性吸附，吸附能力較弱，沒有選擇性。

c/μmol·L-1圖2 2和2′的吸附等溫曲線*Figure 2 Adsorption isothermals of 2 and 2′*Q=20 mg，結(jié)合時間16 h，溶液體積1 mL

分子印跡中常用Scatchard方程[10]評價分子模板聚合物的結(jié)合特性，Scatchard方程可表示為：

Q/C(平衡)=(Qmax-Q)/Kd

式中：Kd為結(jié)合位點的平衡離解常數(shù)；Qmax為結(jié)合位點的最大表觀結(jié)合量；C(平衡)為吸附液中的目標(biāo)分子的平衡濃度

根據(jù)上式，以Q/C(平衡)對Q作圖得Scatchard圖(圖3)。由圖3可見，Q/C(平衡)與Q間存在非線性關(guān)系，充分表明2對于1存在著不等價的兩種結(jié)合位點。對數(shù)據(jù)進行線性相關(guān)處理，由直線的斜率和截距可求得結(jié)合位點的最大表觀吸附量和平衡離解常數(shù)，分別為Qmax,1=130.9 nmol·g-1，Kd,1=30.8 nmol·L-1,Qmax,2=540.5 nmol·g-1，Kd,2=450.5 nmol·L-1。印跡聚合物經(jīng)過研磨過篩，可能使聚合物中的一部分結(jié)合位點受到破壞，使結(jié)合能力有所下降，影響最大表觀結(jié)合量的數(shù)值。

Q/μmol·g-1圖3 2對1的Scatchard曲線Figure 3 Scatchard plot of 2 on 1

2．4 溶劑對結(jié)合能力的影響

在聚合反應(yīng)中，實驗探索了甲苯溶劑作為致孔劑對2結(jié)合能力作用效果(見表1)。由表1可見，僅用EDMA作為交聯(lián)劑和溶劑所制備的2，剛性很強，其最大吸附量Qmax僅是甲苯作溶劑制備的2的1/9，由此可見，甲苯在聚合物形成過程中，制造了相對蓬松的表面形態(tài)，使其剛性有一定程度的下降，既有利于研磨，又較大程度的改善了吸附能力。

表1 不同反應(yīng)溶劑的吸附量Table 1 Adsorption quantity of different solvents

2．5 2的選擇性表征

以V(甲醇) ∶V(水)=5 ∶5為流動相，流速1.0 mL·min-1，進樣量20μL，檢測波長220 nm條件下，用HPLC比較了2對1和西馬津的選擇性。底物原始濃度均為4×10-5mol·L-1(圖4,圖5)，被2吸附后的溶液中1的峰面積明顯降低，而西瑪津的峰面積在吸附前后沒有明顯變化。這充分驗證了2對目標(biāo)分子的專一性識別作用。由于西瑪津分子僅具備有1的官能團而不具有相同的空間構(gòu)型，說明了2并非只對目標(biāo)化合物的官能團有識別，同時對其立體構(gòu)型也有區(qū)分和選擇。

t/min圖4 1和西瑪津的甲醇溶液*Figure 4 Initial mixture methanol solution of 1 and ametryn*c=4×10-5 mol·L-1

t/min圖5 經(jīng)2吸收過的1和西瑪津的甲醇溶液*Figure 5 Mixture methanol solution of 1 and ametryn after the adsorption of 2 *c=4×10-5 mol·L-1

2.6 固相萃取柱的富集作用效果

分子印跡固相萃取柱(MIPs-SPE)對含有c(1)=2×10-8mol·L-1的水樣100 mL進行富集(表2)，吸附能力較強，洗脫后可獲得89.3%的回收率。

表2 MIPs-SPE的富集作用Table 2 Enrichment effect for MIPs-SPE

3 結(jié)論

以莠去津為目標(biāo)分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，AIBN為引發(fā)劑，甲苯為溶劑和致孔劑制備的莠去津分子印跡聚合物機械性好，穩(wěn)定性高，吸附能力在2×10-7mol·L-1至4×10-5mol·L-1間不斷增大，且有一定專一性。將其制備成分子印跡固相萃取柱對于水質(zhì)目標(biāo)分子的回收率可達到近90%，分離效率較高，具備較好的應(yīng)用價值。

[1] 李清波,駱永明,王顏紅. 土壤和玉米籽粒中莠去津殘留量的測定方法[J].分析化學(xué)，2003，31(3)：383．

[2] 張杰. 水中阿特拉津的氣相色譜法測定[J].環(huán)境科技，2008，21(2)：30-31．

[3] 許人驥，魏復(fù)盛，王永華. 氣相色譜法分析尿液樣品中的阿特拉津及其代謝物[J].色譜，2007，25(5)：758-761．

[4] 顏流水，井 晶 ，黃智敏，等. 槲皮素分子印跡聚合物的制備及固相萃取性能研究[J]．分析試驗室，2006，25(5)：97-100．

[5] 時作龍，章竹君 ，孫永華. 在線分子印跡-化學(xué)發(fā)光法對食品中蘇丹紅Ⅰ的測定[J].分析測試學(xué)報，2008，27(10)：1071-1074．

[6] GAO Bao-jiao, WANG Jian, AN Fu-qiang,etal. Molecular imprinted material prepared by novel surface imprinting technique for selective adsorption of pirimicarb[J]．Polymer，2008，49(5):1230-1238．

[7] 劉偉，王兵料. 氟哌酸分子印跡共混膜的制備及結(jié)構(gòu)表征[J].離子交換與吸附，2009，25(1)：1-8．

[8] 朱秋勁，湯堅，戴軍，等.β-雌二醇人工抗體的制備和分子識別性能表征[J].食品科學(xué)，2006，27(10)：45-49．

[9] Bérengère Claude, Philippe Morin, Michel Lafosse. Selective solid-phase extraction of a triterpene acid from a plant extract by molecularly imprinted polymer[J].Talanta，2008，75(2)：344-350．

[10] ZHOU Jie， HE Xi-wen． Study of the nature of recognition in molecularly imprinted polymer selective for 2-aminopyridine[J]．Anal Chim Acta，1999，38l(1)：85-91．