劉樂承，林小芳 (長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

紫菜薹BcMF4基因的克隆及其RNAi植物表達(dá)載體的構(gòu)建

劉樂承，林小芳
(長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

根據(jù)普通白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis,syn.B.rapassp.chinensis)雄性不育相關(guān)基因BcMF4序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，從紫菜薹(B.campestrisssp.chinensisvar.purpuraria)中克隆出了大小為710 bpBcMF4基因片段。采用Gateway技術(shù)，構(gòu)建了BcMF4基因RNA干涉(RNA interference,RNAi)植物表達(dá)載體。為下一步通過沉默BcMF4基因，明確其對(duì)紫菜薹花粉發(fā)育和雄性不育的影響奠定了基礎(chǔ)。

紫菜薹(Brassicacampestrisssp.chinensisvar.purpuraria)；BcMF4基因；克??；RNAi(RNA interference)；表達(dá)載體

BcMF4(BrassicacampestrisMale Fertility 4)基因是從普通白菜(B.campestrisssp.chinensisvar.communisTsenetLee)核雄性不育兩用系中分離得到的一個(gè)雄性不育相關(guān)的隱性基因[1]。目前，已經(jīng)從十字花科植物11個(gè)物種中克隆出了BcMF4的同源基因[2]，而且已經(jīng)證明，在菜心(B.campestrisssp.chinensisvar.parachinensis(Bailey) TsenetLee)、擬南芥(Arabidopsis)中，BcMF4與花粉發(fā)育有著密切關(guān)系[3,4]。然而，至今還沒從紫菜薹(B.campestrisssp.chinensisvar.purpuraria)克隆出BcMF4的同源基因。紫菜薹是十字花科蕓薹屬作物，原產(chǎn)我國，營養(yǎng)價(jià)值極高[5]。紫菜薹早熟品種和中晚熟品種分別于國慶、元旦、春節(jié)前后大量上市，深受大眾的喜愛[6]。本研究擬從紫菜薹中克隆出BcMF4后，采用Gateway技術(shù)構(gòu)建其RNA干涉(RNA interference,RNAi)[7]植物表達(dá)載體，旨在為下一步通過沉默該基因明確其對(duì)紫菜薹雄性不育的影響及分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

田間種植‘十月鮮’紫菜薹，開花期取2.5 mm以上的花蕾[2～4]，立即投入液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室-75 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

T4-DNA連接酶、pGEM-T-easy-vector 購自Promega公司；1 kb DNA Ladder Marker、100-bp DNA Ladder和VITGENE DNA回收試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Taq DNA Polymerase購自Fermentas公司；B型小量質(zhì)粒快速提取試劑盒購自背景博大泰恒生物技術(shù)有限公司；Gateway?BP ClonaseTMII購自Invitrogen公司。PCR引物委托湖北省武漢鼎國生物技術(shù)有限公司合成。IPTG、X-gal、氨芐青霉素、利福平、鏈霉素等購自北京索萊寶科技有限公司。常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

大腸桿菌(E.coli)DH5a菌株、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404工程菌株由長(zhǎng)江大學(xué)許峰博士惠贈(zèng)；pHGRV質(zhì)粒為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)葉志彪教授惠贈(zèng)。

1.2 目的片段的克隆

稱取1.0～1.5 g紫菜薹花蕾，采用CTAB法[8]提取DNA，0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢查、分子檢測(cè)儀檢測(cè)質(zhì)量。根據(jù)文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)1對(duì)引物(B4-1：5’-GCT GGATCC ATC AAG AAG TCC CTT AAC AAC C-3’；B4-2：5’-GCT TCTAGA ACA TCA TCG AAG CAT CAC C-3’)，以提取的紫菜薹DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，63.6 ℃退火45 s，72 ℃延長(zhǎng)45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延長(zhǎng)10 min；4 ℃保存；PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳分離后，用手術(shù)刀切下含目的片段的膠塊，采用VITGENE DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收。取適量的回收DNA與50 ng pGEMRR-T-Easyv-ector在T4連接酶作用下連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株感受態(tài)細(xì)胞。在LB/Amp/IPTG/X-gal篩選平板上篩選重組子，挑選白色菌落經(jīng)LB液體培養(yǎng)后，用B型小量質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖刑崛≠|(zhì)粒DNA(按說明書進(jìn)行)。取適量質(zhì)粒DNA為模板，以B4-1、B4-2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。

1.3 RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建

以帶有目的基因片段的重組質(zhì)粒為模板，用aBttI+和aBttII+進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增(50 μL PCR反應(yīng)液中含有引物10 pmol/L，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 2 min后，94 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 1.5 min，5個(gè)循環(huán))，取10 μL反應(yīng)物至含有40 pmol/L aBtt 通用引物的40 μL PCR反應(yīng)液中進(jìn)行第二輪擴(kuò)增(95 ℃ 1 min后，94 ℃ 15 s，45 ℃ 30 s，68 ℃ 1.5 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 1.5 min，15個(gè)循環(huán)，68 ℃ 延伸5 min)，PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠分離檢測(cè)，回收目的片段。在5 μL BP緩沖液中，依次加入100 ng純化的PCR產(chǎn)物和100 ng帶有attP位點(diǎn)的pHGRV質(zhì)粒DNA，混勻，加入4 μL BP Clonase，25 ℃反應(yīng)過夜。加入1 μL蛋白酶K，37 ℃ 10 min終止反應(yīng)。取反應(yīng)物熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，Str 50 mg/L的LB固體平板篩選陽性克隆。以pHGRV上35S與Intron序列為引物對(duì)陽性克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)[9]。提取陽性重組子質(zhì)粒，CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404[10]，在含Rif 50 mg/L、Str 80 mg/L的LB平板上篩選陽性克隆，菌落PCR檢測(cè)驗(yàn)證，定名為pHGRV-B4。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的獲得

提取的紫菜薹基因組DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(圖1)檢測(cè)后，分子檢測(cè)儀器檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DNA含量為1.86 mg/mL，D260=0.186，D280=0.091，D280/D260=0.49，表明提取的紫菜薹基因組DNA質(zhì)量較好。以B4-1、B4-2為引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的目的片段為單一條帶，大小為710 bp左右(圖2)，與預(yù)期吻合。連接到pGEM-T-Easy-vector載體上后，PCR驗(yàn)證大小為710 bp左右；陽性克隆測(cè)序結(jié)果證實(shí)所擴(kuò)增的條帶為BcMF4基因片段。

M為Marker；A、B為DNA片段圖1 紫菜薹基因組DNA電泳圖Figure1 Electrophoresisofpurplecai?taigenomeDNAM為Marker；A為擴(kuò)增的BcMF4片段圖2 BcMF4基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Figure2 ElectrophoresisofBcMF4fragmentofPCRamplification

2.2 RNAi表達(dá)載體的獲得

M為Marker;A、B為PCR擴(kuò)增片段圖3 RNAi表達(dá)載體的PCR檢測(cè)電泳圖Figure 3 Electrophoresis of RNAi expression vector by PCR detection

經(jīng)過兩輪PCR反應(yīng)獲得帶有aBtt位點(diǎn)的目的基因BcMF4基因片段，然后在BP Clonase作用下，與載體pHGRV上的attP位點(diǎn)發(fā)生重組，將目的基因片段整合到pHGRV上，最終獲得了帶有反向重組BcMF4基因的RNAi植物表達(dá)載體(圖3)。

3 討論

蕓薹屬作物是雜種優(yōu)勢(shì)利用最為普遍的一類作物，而雄性不育系是白菜類等蕓薹屬作物雜種優(yōu)勢(shì)利用的最理想方式，因而其雄性不育的選育及其應(yīng)用基礎(chǔ)的研究深受人們重視。隨著分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段日臻完善，從分子水平上闡明蕓薹屬植物雄性不育的機(jī)理已成為可能。從雄性不育的遺傳基礎(chǔ)著手，了解花粉發(fā)育相關(guān)的基因以及抑制花粉發(fā)育的基因，是揭示雄性不育產(chǎn)生的機(jī)理的有效途徑。但迄今為止，從蕓薹屬植物中分離的花粉、花藥特異表達(dá)基因?yàn)閿?shù)不太多，且多數(shù)基因功能尚不清楚。從普通白菜核雄性不育兩用系中成功分離得到雄性不育相關(guān)的隱性基因BcMF4后，已經(jīng)從十字花科植物11個(gè)物種中克隆出了同源基因，而且已經(jīng)證明，在擬南芥、菜心中與花粉發(fā)育有著密切關(guān)系[3,4]。本研究從紫菜薹克隆出了BcMF4基因的同源片段，為下一步研究奠定了基礎(chǔ)。當(dāng)然，還需通過RACE等方法克隆出BcMF4基因的全序列，以進(jìn)一步證實(shí)所克隆片段的正確性。

RNAi現(xiàn)象普遍存在于植物和動(dòng)物中，這一現(xiàn)象一經(jīng)發(fā)現(xiàn)馬上就引起了人們的高度重視，并迅速發(fā)展成為一種強(qiáng)大的“基因沉默”技術(shù)，廣泛應(yīng)用于各種生物的基因功能鑒定和功能基因表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域[11]。RNAi的關(guān)鍵在于表達(dá)載體的構(gòu)建。但是，以往RNAi植物表達(dá)載體的構(gòu)建十分繁瑣，耗時(shí)費(fèi)錢[3,4]。本研究采用Gateway技術(shù)，不再需要使用限制性內(nèi)切酶和連接酶，操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)條件易于控制，陽性克隆通過PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳即可檢測(cè)，獲得的表達(dá)載體能直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化，從而為下一步通過沉默BcMF4基因，明確其對(duì)紫菜薹花粉發(fā)育和雄性不育的影響奠定了基礎(chǔ)。

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2010-10-16

湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2007ABA386)

劉樂承(1964-)，男，湖北洪湖市人，農(nóng)學(xué)博士，教授，主要從事園藝植物遺傳育種的教學(xué)與研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.04.013

Q785

A

1673-1409(2010)04-S044-03