李誠博， 程笑晨， 劉晨光

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

熒光微球在多領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用，例如污染檢測[1-2]、生物標(biāo)記[3]、體內(nèi)或體外成像[4]、藥物運送[5]、疾病診斷[6]、免疫分析等[7]。熒光微球可以通過多種材料進行制備，包括多聚物[8]、硅[9]以及磁性粒子[10]。常用的熒光微球制備方法有2種：第一種是制備微球時將染料與原料混合[11]，另一種方法是在微球成功制備后再添加染料[12]。在熒光微球中的制備過程中，通常使用有機染料和量子點做為熒光基團。然而，應(yīng)用這些材料有許多缺點，例如使用量子點作為熒光基團會產(chǎn)生一定的毒性[13-14]，有機染料會導(dǎo)致光漂白現(xiàn)象的發(fā)生[15]，有些熒光染料甚至?xí)l(fā)生熒光泄漏[16]。為了克服量子點和有機染料的不足，亟需探索新的制備方法。通過化學(xué)修飾得到的具有良好物化性質(zhì)的多聚物是一種制備熒光微球材料的理想選擇，因為這些材料具有抗光漂白特性以及熒光發(fā)射的均一性[17-18]等優(yōu)點。

最近，由于熒光多糖材料的良好的相容性，其在微球的制備中受到了越來越多的關(guān)注。瓊脂糖，是一種可以被廣泛應(yīng)用到生物醫(yī)藥和生物工程中的一種紅藻多糖。由于其獨特的性質(zhì)，例如親水性、多孔性、長時間穩(wěn)定性以及無毒性[2,19]，瓊脂糖成為一種理想的制備微球的材料。瓊脂糖的基本二糖單元包括1,3連接的β-D-半乳糖和1,4連接的α-L-3,6-脫水半乳糖[20]。目前，對于熒光瓊脂糖的研究有將瓊脂糖與色氨酸接枝[21]，利用色氨酸的天然熒光特性使之具有熒光，另外還可將與萘乙酰[22]、腺嘌呤[23]等物質(zhì)與瓊脂糖接枝使之具有熒光，而沒有關(guān)于單純的瓊脂糖與羅丹明B的熒光接枝產(chǎn)物的相關(guān)文章。本文將羅丹明B這種常見的熒光染料進行接枝熒光標(biāo)記，可以減輕成本，同時也可以拓寬熒光指示材料的應(yīng)用范圍。此外，本實驗中使用水水乳化的方法制備瓊脂糖微球也具有很大優(yōu)勢，因為這個方法避免了有機溶劑[24]和表面活性劑的應(yīng)用，從而減少聚集、降低污染[25]。

在本文中，我們選擇羅丹明B作為熒光素合成了瓊脂糖-羅丹明B(RB)接枝的多聚物(ARB)，檢測了其物理和化學(xué)特性。此外，本文還通過水水乳化方法制備瓊脂糖熒光微球并檢測其熒光特性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和儀器

主要材料和儀器：瓊脂糖(BIOWEST公司)，環(huán)氧氯丙烷(天津廣成化學(xué)有限公司)，羅丹明B(國藥集團)，攪拌機(RW20，IKA)，熒光分光光度計(F-4500 FL Spectrophotometer，HITACHI)，熒光顯微鏡(Eclipse 50i，Nikon)，掃描電子顯微鏡(JSM-6380,JEOL)，傅里葉紅外光譜儀(Impact 410，Nicolet)，X射線衍射儀(ARLTMEQUINOX 100 X，Thermo)，熒光酶標(biāo)儀(VarioskanFlash,Thermo)。其余都為從國藥集團采購的分析純試劑。

1.2 瓊脂糖的活化

瓊脂糖的活化是將活潑的環(huán)氧基團引入瓊脂糖凝膠上，瓊脂糖凝膠與親和配基在常溫或低溫下反應(yīng)，可以制備親和吸附介質(zhì)。將0.3 g瓊脂糖溶于3 mL蒸餾水中，將6 mL環(huán)氧氯丙烷溶液與21 mL蒸餾水混合。瓊脂糖和環(huán)氧氯丙烷的終濃度分別為1%和5%，混合溶液體積為30 mL。使用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH為10，并用攪拌器80 ℃連續(xù)攪拌3 h即可。

1.3 羅丹明B的交聯(lián)

活化后的瓊脂糖與羅丹明B的羧基發(fā)生反應(yīng)，起到化學(xué)交聯(lián)的目的。取一定量的羅丹明B加入到活化后的瓊脂糖中，并在80℃下持續(xù)攪拌3 h，瓊脂糖與羅丹明發(fā)生接枝反應(yīng)。隨后，加入90 ml的無水乙醇使之沉淀，再將接枝產(chǎn)物進行凍干處理后，收集備用。反應(yīng)示意圖見圖1。

(a.瓊脂糖的羥基與環(huán)氧氯丙烷的-Cl在堿性環(huán)境中發(fā)生置換反應(yīng)；b.中間產(chǎn)物隨后與羅丹明發(fā)生接枝反應(yīng)。a.One of hydroxyl groups of agarose replaced the -Cl of epichlorohydrin at the alkaline environment; b.The intermediate products grafted with RB subsequently.)

圖1 瓊脂糖與羅丹明接枝的反應(yīng)示意圖
Fig. 1 The reaction formula of agarose and RB

1.4 性質(zhì)檢測

顯微鏡定性觀察。利用光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡來觀察修飾后的瓊脂糖形態(tài)及其熒光特性。檢測微觀形態(tài)以及驗證合成產(chǎn)物是否產(chǎn)生熒光。采用綠光激發(fā)羅丹明B產(chǎn)生紅光，激發(fā)波長為580 nm，發(fā)射波長為610 nm。

紅外檢測。將2 mg樣品與100 mg KBr混合研磨成粉末，再用壓片機壓成薄片。紅外檢測設(shè)定分辨率為4 cm-1，掃描數(shù)量為64遍，信噪比為25 000。記錄光譜范圍在400～4 000 cm-1。

X-射線衍射檢測晶體性。對照實驗選用空白樣品，用塑料封裝，得到平滑的背景，并且無擴散的晶體峰。X衍射采用的是粉末衍射儀，電壓、電流分別為40 kV和150 mA。X射線衍射圖案在角方位為20°～90°，步長為0.05°。晶格參數(shù)通過里特維德方法測定衍射模式[26]。

1.5 羅丹明接枝瓊脂糖的熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜

將修飾后的瓊脂糖通過熒光分光光度計進行激發(fā)波長掃描與發(fā)射波長掃描檢測。首先固定激發(fā)波長，在300～750 nm范圍內(nèi)進行掃描，每隔10 nm計數(shù)一次，繪制相應(yīng)波長下熒光強度的散點圖，為激發(fā)光的波長掃描圖。同理，發(fā)射光的波長掃描圖是固定發(fā)射波長，進行上述相同操作。由此分別確定最佳的發(fā)射波長和激發(fā)波長，并與羅丹明B進行對比，檢測化學(xué)合成后熒光性質(zhì)是否變化。

1.6 修飾后瓊脂糖微球的乳化制備

羅丹明B修飾后的瓊脂糖可以通過水油乳化法[27-28]或水水乳化法制備微球[29]。水油乳化法具體步驟如下：首先，將上述步驟制得的瓊脂糖于80 ℃溶于水，配置成1.5%溶液，加入到含有1%司班80的液體石蠟中，按照水油兩相比例為1∶8，加入瓊脂糖3 mL，液體石蠟24 mL，80 ℃、1 600 r/min條件下乳化30 min，隨后取出冰浴冷卻固化，離心后凍干保存。

水水乳化法具體步驟如下：將上述步驟制得的瓊脂糖溶于水中，加熱至80 ℃使之溶解，配置成2%溶液作為分散相。PEG10000溶于水，按照質(zhì)量體積比配制成20%水溶液。隨后，將2.5 mL制得的瓊脂糖溶液逐滴加入到25 mL的PEG溶液中，70 ℃、1 800 r/min條件下攪拌30 min。微球形成后，停止攪拌，將體系放入冰水浴中固化30 min。將固化后的體系進行離心沖洗3次，再進行凍干處理，隨后室溫保存。

1.7 微球的形態(tài)學(xué)觀察

將微球分散到蒸餾水中后，使用光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)，在放大200×?xí)r，使用數(shù)字圖像處理軟件捕獲顯微照片。通過掃描電子顯微鏡(1 600×)觀察瓊脂糖微球細微形態(tài)。樣品首先經(jīng)過凍干處理，處理后的樣品放在載玻片上，在充滿氬氣的空間中，濺射噴涂上金-鈀層。涂層后的樣品在20 kV的加速電壓下觀察，凍干后的微球大小、形態(tài)、粒徑等。同時，微球的熒光特性可以通過熒光顯微鏡進行觀察。在200×的放大條件下，采用綠色熒光激發(fā)，觀察微球是否有熒光特性。

1.8 粒徑分布

基于動態(tài)光散射的粒度分析儀可以用來檢測和分析微球的各種參數(shù)?？梢砸罁?jù)直方圖及累積曲線進行隨后的數(shù)據(jù)分析。平均粒徑在該儀器中定義為D50，表示為所有微球按照粒徑從小到大累積到50%時微球的粒徑。檢測時溫度維持在25 ℃。

1.9 微球的熒光接枝穩(wěn)定性

通過熒光接枝穩(wěn)定性，來考察制備熒光修飾瓊脂糖微球的必要性。本文制備了兩種微球，一種為非接枝的熒光瓊脂糖微球，即直接制備瓊脂糖微球，在制備過程中包埋液體羅丹明B。另一種為采用修飾后的羅丹明B接枝瓊脂糖熒光材料制備熒光微球。具體如下，用蒸餾水做對照，將0.1、0.5、1 mL的1%羅丹明B與1.5%的瓊脂糖混合，采用水水乳化法制備微球。同時，將修飾后的瓊脂糖設(shè)置兩個梯度，初始羅丹明加樣量分別為1.25%和5%(v/v)。將所有微球放入透析袋中，外部液體為蒸餾水，體系溫度為37 ℃，于100 r/s轉(zhuǎn)速輕微攪拌。按照時間間隔0、1、2、3、4、5、6、8、12、24、36、48、60 h，取出1 mL液體，隨后用蒸餾水補齊體積。通過酶標(biāo)儀測定濃度，激發(fā)波長580 nm，發(fā)射波長610 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 羅丹明B接枝瓊脂糖的合成與表征

羅丹明B與瓊脂糖的修飾中間物為環(huán)氧氯丙烷。環(huán)氧氯丙烷是一種雙功能試劑，帶有環(huán)氧基團和-Cl基團。在活化的同時，瓊脂糖能夠達到一定程度的交聯(lián)。不但能夠增加瓊脂糖的機械性能，還可以增強其對強堿和高溫的耐受性。具體來說(見圖1)，在堿性條件下，瓊脂糖的一個羥基替代了環(huán)氧氯丙烷的-Cl，如反應(yīng)式1。在相同的條件下，環(huán)氧氯丙烷的環(huán)氧基斷裂，與羅丹明B的羥基相連，于是中間產(chǎn)物與羅丹明B也會發(fā)生連接反應(yīng)，如反應(yīng)式2。羅丹明B接枝的瓊脂糖置于光學(xué)顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)修飾后瓊脂糖與單純瓊脂糖外觀基本一致，之后我們又在同一視野中觀察熒光特性，結(jié)果表明修飾成功表現(xiàn)為具有羅丹明B的熒光特性，即在綠光激發(fā)的條件下，顯微鏡視野中會出現(xiàn)發(fā)射紅光的物質(zhì)。

2.2 紅外檢測

為了更進一步確定羅丹明B和瓊脂糖的接枝，我們將單純瓊脂糖，合成后瓊脂糖分別進行紅外光譜檢測(見圖2)。把單純瓊脂糖與修飾后瓊脂糖作為一個單元對比，同時也將不同取代度的瓊脂糖作為一個單元進行對比。

如圖2a，羅丹明已經(jīng)與瓊脂糖進行了化學(xué)交聯(lián)。瓊脂糖在3 423.31 cm-1表現(xiàn)出羥基振動，在2 896.34 cm-1表現(xiàn)出碳氫鍵的伸縮振動，在1 640.95 cm-1表現(xiàn)出碳碳雙鍵的伸縮振動，在1 371.77 cm-1表現(xiàn)出碳氫鍵的彎曲振動。對于修飾后的瓊脂糖，在2 896.34和1 371.77 cm-1峰處有減弱現(xiàn)象，原因為接枝羅丹明B后碳氫鍵所占比例減少，導(dǎo)致所吸收的量在總體比例下減少。同時在2 357.47 cm-1處多出了一個峰，此峰代表了累積雙鍵的非對稱伸縮振動，代表了羅丹明B中的累積雙鍵，由此可以證明羅丹明B已經(jīng)經(jīng)過化學(xué)交聯(lián)與瓊脂糖在一起。

(a．瓊脂糖和羅丹明B接枝瓊脂糖的紅外光譜，綠線代表瓊脂糖紅外光譜，紅線代表經(jīng)過羅丹明B修飾的瓊脂糖；b. 不同濃度的接枝瓊脂糖的紅外光譜。a. The IR spectroscopy of agarose and ARB; b. The IR spectroscopy of two different kind of ARB.)

圖2 瓊脂糖和羅丹明B接枝瓊脂糖的紅外光譜
Fig. 2 The IR spectroscopy of agarose and ARB

如圖2b，從不同濃度的接枝瓊脂糖的紅外光譜可以看出，隨著羅丹明B量的增加，2 357.47cm-1峰越強。由此可以從側(cè)面說明羅丹明的取代程度與羅丹明B的添加量有關(guān)。

2.3 X-射線衍射檢測

瓊脂糖和修飾后瓊脂糖的X衍射圖譜如圖3所示，所有的衍射圖譜中都沒有發(fā)現(xiàn)明顯的高峰，意味著瓊脂糖和修飾后瓊脂糖都是無定形狀態(tài)，即非晶體性。觀察圖像發(fā)現(xiàn)，修飾后瓊脂糖的X衍射強度比單純瓊脂糖的強度低，這是因為在瓊脂糖的基礎(chǔ)上接枝羅丹明，會使結(jié)構(gòu)更加緊密[30-31]，在相同的體積下，修飾后瓊脂糖的密度大于單純瓊脂糖。

2.4 熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜

羅丹明B修飾瓊脂糖粉末在熒光顯微鏡下觀察顯示，當(dāng)被綠光激發(fā)時，會發(fā)出紅色熒光，與羅丹明B相同。這可以部分證實羅丹明B與瓊脂糖接枝。同時，分別測量羅丹明B和羅丹明B接枝瓊脂糖的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，并對比研究羅丹明B和羅丹明B接枝瓊脂糖的熒光性質(zhì)(見圖4)。

(a．瓊脂糖；b. 羅丹明B接枝瓊脂糖。a. RB; b. ARB.)圖3 瓊脂糖和羅丹明B修飾瓊脂糖的X衍射圖像Fig. 3 The X-ray diffraction of agarose and ARB

(a．羅丹明B；b.羅丹明B接枝瓊脂糖。a. RB; b. ARB.)圖4 羅丹明B和羅丹明B接枝瓊脂糖的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜Fig. 4 Thefluorecent spectra of rhodamin B and ARB.

如圖4，修飾后瓊脂糖的熒光特性與羅丹明B基本相同，激發(fā)波長都在560 nm左右，發(fā)射波長都為580 nm。所以修飾后瓊脂糖中的羅丹明B性質(zhì)并未發(fā)生改變[32-33]。因此，在以后的檢測中可以按照羅丹明B的標(biāo)準(zhǔn)，增加了使用的方便性。

2.5 熒光微球的形態(tài)學(xué)觀察

修飾后瓊脂糖熒光微球的形態(tài)學(xué)觀察可以利用多種技術(shù)(見圖5)。采用光學(xué)顯微鏡(200×)(見圖5a)，可以清晰觀察到微球，由于其為冷凝固化，瓊脂糖的表面不是規(guī)則的平滑；羅丹明B修飾的瓊脂糖微球的內(nèi)部較單純瓊脂糖微球更加致密。圖5b為在同一視野中采用熒光顯微鏡觀察，采用綠光激發(fā)，發(fā)現(xiàn)熒光微球與羅丹明和修飾后瓊脂糖一樣，都產(chǎn)生紅色熒光。通過掃描電子顯微鏡進一步觀察微球的形態(tài)(見圖5c)，發(fā)現(xiàn)微球具有較好的球形度，且未觀察到明顯及大量的損傷，這是因為微球有較好的機械性能，進行凍干處理的機械行為不會導(dǎo)致明顯和巨大的損害。上述結(jié)果一致說明通過水水乳化制備的瓊脂糖熒光微球具有良好球形的外部特征。在先前的研究中，水水乳化法被用于其他多種材料的微球制備[27-28,34]，同樣是溫和的條件，也可以制備出良好球形的微球。

(a.光學(xué)顯微鏡觀察；b.同一視野中熒光顯微鏡觀察；c.掃描電子顯微鏡觀察。a.Under optical microscope;b.Under fluorescence micro scope;c.Under SEM.)

圖5 微球的外部形態(tài)
Fig. 5 The morphology of the microparticles

相較于水油乳化，水水乳化法是一種較新的微球制備方法。所選用的材料無毒，無有機溶劑，制備條件溫和，從而不會對包埋的生物活性大分子或細胞造成危害；所得凝膠微球圓整度較好，表面光滑，微球粒徑較為均一。

2.6 微球粒徑分析

通過修飾后瓊脂糖微球的掃描電鏡照片以及粒度分析，可以進行微球的粒度分散分析。如圖6所示，按照條件制備的微球平均粒徑為44 μm，在直方圖中微球粒徑分布有2個高峰，分別在5和70 μm左右，具有兩個峰的現(xiàn)象是傳統(tǒng)的乳化結(jié)果[35-36]。上述結(jié)果說明水水乳化和水油乳化方法制備的瓊脂糖微球在物理性質(zhì)方面具有很高的相似性。

圖6 微球的粒徑分布Fig. 6 The range of particle sizes of microparticles

2.7 熒光接枝穩(wěn)定性

將修飾后熒光微球與單純包埋羅丹明B的瓊脂糖微球進行了比較(見圖7)，發(fā)現(xiàn)單純包埋的瓊脂糖微球體系中微球的熒光強度在12 h內(nèi)減少迅速，一直到60 h后基本平緩。加入越多的羅丹明B，整個體系的熒光強度越高，即初始熒光強度也越高。對于經(jīng)過修飾后的瓊脂糖熒光微球，只有熒光強度的微小變化，可以歸結(jié)為隨機波動，整體熒光強度沒有變化。這個結(jié)果說明羅丹明B與瓊脂糖接枝后連接緊密，表現(xiàn)為十分穩(wěn)定的分子。并且在60 h內(nèi)沒有觀察到溶液的變化，即沒有羅丹明B的出現(xiàn)。于是制備熒光接枝穩(wěn)定性的微球具有很大必要性，熒光穩(wěn)定的微球在今后的研究中將具有更廣泛的應(yīng)用。

圖7 熒光微球與單純包埋羅丹明B的瓊脂糖微球的熒光接枝穩(wěn)定性Fig. 7 The time stability of fluorescent microparticles and simple RB embedded microparticles

3 結(jié)語

羅丹明修飾的瓊脂糖可以通過環(huán)氧氯丙烷活化的方法實現(xiàn)。這個獨特并且高效的方法可以將羅丹明B接枝到瓊脂糖上，形成一種新的化合物。由于羅丹明B基團的存在，修飾后的瓊脂糖具有了熒光特性，其熒光特性與羅丹明B基本相同。采用修飾后瓊脂糖制備熒光微球，通過水水乳化法，可以使熒光特性得到長時間的保存。熒光微球在細胞標(biāo)記，生物大分子標(biāo)記中應(yīng)用廣泛。這種熒光微球可以應(yīng)用于生物分子的標(biāo)記與分析，或者作為示蹤物，具有熒光強度高、光譜性質(zhì)穩(wěn)定等特性。