劉春艷，柏沫含，徐雨靚，萬(wàn)天妍，陳佳琪，王清清，馬 濤

可溶微針作為新型經(jīng)皮給藥制劑，可以有效突破皮膚角質(zhì)層屏障，解決經(jīng)皮遞藥系統(tǒng)遞藥效率低的瓶頸問題，實(shí)現(xiàn)近似于注射給藥的治療效果[1-2]；同時(shí)可完全溶解的微米級(jí)的針部又使其具有無(wú)痛、微創(chuàng)、便于病人自主給藥、無(wú)廢棄針頭二次危害等諸多優(yōu)點(diǎn)[3]。因此，近年來(lái)，可溶微針成為新型遞藥系統(tǒng)研究的主要方向之一，具有極大的臨床應(yīng)用前景。但是，該種給藥方式藥物在體內(nèi)的分布、代謝、消除情況及其與皮下注射的區(qū)別等尚缺乏相應(yīng)的研究。

本課題組以透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)和聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP K90)作為制針輔料，包載可溶性藥物，用兩步注模干燥法制備出可溶微針貼片，進(jìn)行大鼠體內(nèi)給藥研究。為了更深入地研究可溶微針經(jīng)皮給藥的藥物體內(nèi)過(guò)程，直觀、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)地比較皮下注射與可溶微針兩種方式給藥后，藥物在動(dòng)物體內(nèi)的分布情況，具有實(shí)時(shí)觀測(cè)記錄熒光染料體內(nèi)分布的小動(dòng)物活體成像實(shí)驗(yàn)是優(yōu)選的方法。羅丹明B是一類人工合成的以氧雜蒽作為母體的熒光染料，可溶于水，并具有良好的光學(xué)穩(wěn)定性和較高的量子產(chǎn)率，廣泛應(yīng)用于信息科學(xué)、激光染料、環(huán)境化學(xué)、生物醫(yī)藥科學(xué)和分析化學(xué)等領(lǐng)域[4-5]，符合可溶微針的載藥特點(diǎn)，可作為本研究的模型藥物進(jìn)行在體給藥和活體成像實(shí)驗(yàn)。

為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確，需要建立一種快速、便捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，不僅能排除可溶微針輔料的干擾，還能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出可溶微針中羅丹明B的載藥量。本研究旨在采用紫外-可見分光光度法建立一種準(zhǔn)確可靠的可溶微針貼片中羅丹明B的含量分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；FA2204N型電子分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；Advantage A10純水儀(Milli-Q公司)。

1.2 試藥 可溶微針貼片(自制)；羅丹明B(上海圻明生物科技有限公司)；HA(華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司，批號(hào):1806151)；PVP K90(德國(guó)BASF，批號(hào)：L96014768E0)；水為超純水。

1.3 溶液的配制

1.3.1 羅丹明B貯備液的配制 精密稱取羅丹明B固體粉末0.005 2 g，置于100 mL容量瓶中，用超純水溶解并定容至刻度線，配制濃度為52 μg/mL的羅丹明B貯備液。

1.3.2 制針輔料溶液的配制 分別精密稱取HA、PVP K90各0.025 0 g，置于50 mL容量瓶中，用超純水溶解并定容至刻度線，配制濃度為 0.5 mg/mL的制針輔料貯備液。

1.3.3 可溶微針貼片水溶液的制備 用手術(shù)刀片對(duì)已制備好的可溶微針貼片進(jìn)行針部與基層分離，取針部溶解于1 mL 超純水中即得[6]。

1.4 檢測(cè)波長(zhǎng)與專屬性試驗(yàn) 取1.3項(xiàng)下的羅丹明B、HA、PVP K90貯備液以及可溶微針貼片水溶液，以超純水為空白試劑分別稀釋成適宜濃度水溶液，并于200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，得到其紫外光譜圖。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取1.3.1項(xiàng)下羅丹明B貯備液稀釋成濃度為10.4 μg/mL的水溶液，再精密量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，以超純水定容，得到濃度為1.04、2.08、3.12、4.16、5.20、6.24、7.28、8.32、9.36、10.4 μg/mL的羅丹明B系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別測(cè)量其在554 nm處的吸光度，以吸光度(Y)對(duì)羅丹明B濃度(X)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 精密度試驗(yàn) 取1.3.1項(xiàng)下羅丹明B貯備液稀釋到濃度為5.20 μg/mL羅丹明B溶液，在554 nm處連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算日內(nèi)精密度，3 d 內(nèi)每天同法測(cè)定，計(jì)算日間精密度。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取實(shí)驗(yàn)室自制的同一批可溶微針貼片6片，分別用手術(shù)刀片將針部與基層分離，取針部分別置于1 mL 超純水中，振搖時(shí)其完全溶解，測(cè)量其在554 nm處的吸光度，計(jì)算每片可溶微針貼片針部的羅丹明B含量。

1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取0.005 0 g羅丹明B于100 mL容量瓶中得到濃度為50 μg/mL的羅丹明B溶液，取1.3.2項(xiàng)下的制針輔料溶液，按照羅丹明B與混合輔料的濃度比為1∶40、1∶20、1∶10配制藥物輔料混合溶液。其中混合輔料濃度保持不變，總濃度為100 μg/mL，各輔料均為50 μg/mL。羅丹明B濃度分別為2.5、5.0、10.0 μg/mL。將混合溶液在544 nm處測(cè)量吸光度，并通過(guò)線性方程計(jì)算相應(yīng)的濃度。

1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取可溶微針貼片溶液，分別于 0、0.5、1、2、4、6、12、24 h 進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)與專屬性試驗(yàn) 羅丹明B在259、284、355、400、554 nm處均有吸收，其中，在554 nm處吸收最大，且空白試劑無(wú)干擾，而各制針輔料在554 nm處沒有吸收，表明制針輔料對(duì)羅丹明B含量測(cè)定無(wú)干擾。選擇554 nm作為羅丹明B的檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果見圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以吸光度(Y)對(duì)羅丹明B濃度(X)進(jìn)行線性回歸，線性回歸方程為Y=0.064 9X+ 0.003 3(r=0.999 5)，羅丹明B濃度在1.04～10.40 μg/mL范圍內(nèi)，與其吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn) 在554 nm測(cè)定5.20 μg/mL羅丹明B溶液，日內(nèi)精密度為1.04%(見表1)，日間精密度為1.51%(見表2)。

表1 紫外-可見分光光度法測(cè)定羅丹明B日內(nèi)精密度結(jié)果(n=3)

表2 紫外-可見分光光度法測(cè)定羅丹明B日間精密度結(jié)果(n=3)

2.4 加樣回收率試驗(yàn) 2.5、5.0、10.0 μg/mL的羅丹明B回收率分別為95.96%、97.13%、97.87%，RSD分別為0.32%、0.16%、0.21%(見表3)。

表3 紫外-可見分光光度法測(cè)定羅丹明B加樣回收率結(jié)果

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 6片可溶微針貼片中羅丹明B含量為83.8、81.0、81.3、83.4、82.2、83.6 mg，RSD為1.48%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 24 h內(nèi)測(cè)定羅丹明B吸光度的RSD值為2.13%(n=8)。

3 討論

羅丹明B在水溶液中具有強(qiáng)烈的熒光，本研究前期采用熒光分光光度法檢測(cè)羅丹明B的含量，但發(fā)現(xiàn)具有強(qiáng)烈的熒光淬滅現(xiàn)象，羅丹明B濃度愈高，則淬滅愈嚴(yán)重，這可能是因?yàn)楦邼舛攘_丹明B體系中存在自熄滅作用，引起淬滅的因素較多，這可能會(huì)導(dǎo)致微針貼片中羅丹明B的含量測(cè)定不準(zhǔn)確。此外，采用熒光分光光度法測(cè)定羅丹明B系列標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨著羅丹明B濃度增大，發(fā)射波長(zhǎng)出現(xiàn)紅移現(xiàn)象?；谝陨显?，本研究最終未采用熒光分光光度法，選擇紫外-可見分光光度法測(cè)量可溶微針貼片中羅丹明B的含量。

目前羅丹明B的測(cè)定方法多采用高效液相色譜法，而紫外可見分光光度法相對(duì)高效液相色譜法測(cè)定羅丹明B具有簡(jiǎn)便快捷的優(yōu)勢(shì)。羅丹明B是一種熒光物質(zhì)，可以通過(guò)小動(dòng)物成像系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，為了探討可溶微針制劑是否具有緩釋作用，我們以羅丹明B溶液作為對(duì)照組，羅丹明B可溶微針作為實(shí)驗(yàn)組，建立紫外-可見分光光度法對(duì)可溶微針中羅丹明B進(jìn)行定量，從而保證兩個(gè)組別的羅丹明B含量相等，進(jìn)而進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。