李靜，肖健夫，陳杰，廖小軍

1(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083)2(清華大學(xué)電機(jī)工程與應(yīng)用電子技術(shù)系，北京，100084)

高壓脈沖電場(chǎng)對(duì)蘋果汁中大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的鈍化效果*

李靜1，肖健夫2，陳杰2，廖小軍1

1(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083)2(清華大學(xué)電機(jī)工程與應(yīng)用電子技術(shù)系，北京，100084)

研究了高壓脈沖電場(chǎng)(pulsed electric fields，PEF)對(duì)接種于蘋果清汁中的大腸桿菌(Escherichia coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylocuccus aureus)的鈍化效果。研究顯示，隨著電場(chǎng)強(qiáng)度、處理時(shí)間和樣品電導(dǎo)率的增大，PEF對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的鈍化效果增加，其中金黃色葡萄球菌對(duì)PEF更敏感。電場(chǎng)強(qiáng)度和處理時(shí)間均對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殘活率對(duì)數(shù)值lgS有極顯著影響(P＜0.01)。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的臨界電場(chǎng)強(qiáng)度EC分別為15.9 kV/cm和16.4 kV/cm。雙極性脈沖比單極性脈沖對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的鈍化效果好(P＜0.01)。輸入能量密度越高，PEF對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的鈍化效果越好。

高壓脈沖電場(chǎng)，蘋果汁，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌

熱殺菌技術(shù)是食品加工保藏的重要手段，但它會(huì)破壞食品的色、香、味、功能性及營(yíng)養(yǎng)成分，隨著廣大消費(fèi)者對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)、感官品質(zhì)的要求越來(lái)越高，非熱加工技術(shù)的應(yīng)用將成為一種發(fā)展趨勢(shì)［1］。高壓脈沖電場(chǎng)(PEF)作為一項(xiàng)新興的非熱加工技術(shù)，具有能耗低，溫升小，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，能最大程度地減少對(duì)食品品質(zhì)的破壞，受到科研人員關(guān)注［2］。PEF殺菌效果會(huì)受到處理因素(電場(chǎng)強(qiáng)度、處理時(shí)間、脈寬、頻率、脈沖波形、單雙極性、處理溫度等)、產(chǎn)品因素(食品成分、電導(dǎo)率、pH值、水分活度等)和微生物因素(微生物種類、濃度、生長(zhǎng)期等)的影響［3-4］。

目前，國(guó)內(nèi)外就PEF對(duì)蘋果汁的殺菌已有一些研究。鐘葵等發(fā)現(xiàn)，電場(chǎng)強(qiáng)度為25 kV/cm、脈沖數(shù)為1 035個(gè)，PEF處理可以降低蘋果汁中微生物的數(shù)量，但降低不到2個(gè)對(duì)數(shù)［5］。Evrendilek等研究了脈沖極性和處理時(shí)間對(duì)接種于蘋果汁中E.coli O157:H7的鈍化效果，發(fā)現(xiàn)單雙極性之間不存在顯著性差異，當(dāng)處理時(shí)間在3～1 430 μs時(shí)，20 μs的鈍化效果最佳［6］。Ribeiro等研究電場(chǎng)強(qiáng)度和處理時(shí)間對(duì)接種于蘋果汁中金黃色葡萄球菌的鈍化效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，電場(chǎng)強(qiáng)度和處理時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)增加鈍化效果［7］。

為了更系統(tǒng)地研究PEF對(duì)蘋果汁中微生物的殺菌效果，試驗(yàn)研究了電場(chǎng)強(qiáng)度、處理時(shí)間、單雙極性、電導(dǎo)率對(duì)接種于蘋果清汁中的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌鈍化效果的影響，并探討了輸入能量密度與PEF鈍化效果的關(guān)系，為PEF實(shí)驗(yàn)或工業(yè)生產(chǎn)中殺菌效果的預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蘋果汁制備

蘋果汁為市購(gòu)100%蘋果汁，試驗(yàn)前用1 mol/L NaOH溶液于室溫下調(diào)果汁的pH值為3.7，1 mol/L NaCl溶液于 25℃ 調(diào)果汁電導(dǎo)率為 1.0、1.5 或 2.0 mS/cm，之后果汁于121℃滅菌20 min，冷卻后接種目標(biāo)微生物。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

大腸桿菌(CGMCC1.90)、金黃色葡萄球菌(CGMCC1.1861)，均購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。試驗(yàn)所用固體培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司)，液體培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯。營(yíng)養(yǎng)肉湯:蛋白胨，10.0 g;牛肉膏，3.0 g;NaCl，5.0 g;蒸餾水，1 000 mL，pH 值 7.0，121℃ 下滅菌20 min，冷卻后于4℃放置待用。

1.3 微生物培養(yǎng)與測(cè)定

用接種環(huán)從斜面挑取適量目標(biāo)微生物接入營(yíng)養(yǎng)肉湯，分別在37℃下培養(yǎng)12 h(大腸桿菌)、18 h(金黃色葡萄球菌)，使其達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)早期。將培養(yǎng)好的菌液于4℃下，5 500 r/min離心10 min，棄去上清液，菌體復(fù)溶于無(wú)菌水中離心洗滌2次后，溶于與營(yíng)養(yǎng)肉湯等量的無(wú)菌蘋果汁中，使微生物的數(shù)量達(dá)到10～10CFU/mL。將PEF處理前后的蘋果汁倒平板，放置37℃下培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。殺菌效果采用殘活率對(duì)數(shù)值lgS表示:

式中:N為PEF處理后的微生物數(shù)量，CFU/mL;N0為PEF處理前的微生物數(shù)量，CFU/mL。

1.4 PEF殺菌系統(tǒng)

試驗(yàn)所用的高壓脈沖電場(chǎng)殺菌設(shè)備(圖1)為中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)與清華大學(xué)自主研發(fā)設(shè)計(jì)，主要由高壓脈沖發(fā)生裝置、數(shù)據(jù)采集控制系統(tǒng)、處理室和無(wú)菌操作系統(tǒng)4部分組成。處理室出口的精密熱電阻溫度計(jì)可迅速測(cè)得樣品溫度。PEF主要試驗(yàn)參數(shù)見(jiàn)表1。

物料殺菌處理流動(dòng)方向:進(jìn)料口→齒輪泵→處理室→出料口。每次試驗(yàn)前，用50 mg/L ClO2消毒液清洗管道15 min，再以無(wú)菌去離子水清洗20 min，同時(shí)無(wú)菌柜里紫外殺菌20min以保證無(wú)菌環(huán)境。PEF處理過(guò)程中樣品放置在冰水浴里，以最大程度保證微生物處于穩(wěn)定生長(zhǎng)早期。樣品連續(xù)通過(guò)PEF處理室，待PEF設(shè)備穩(wěn)定工作13 min后，開始取樣，1 min取1次，連續(xù)取3次。處理后樣品溫度低于60℃。

圖1 PEF試驗(yàn)裝置圖

表1 PEF主要試驗(yàn)參數(shù)

1.5 試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象，接種于蘋果汁，電導(dǎo)率為 1.0、1.5、2.0 mS/cm，電場(chǎng)強(qiáng)度為 25、30、35、40 kV/cm，時(shí)間為 37、56、74 μs，波形為單、雙極性。

1.6 數(shù)據(jù)處理

1.6.1 PEF電場(chǎng)強(qiáng)度E和處理時(shí)間t的計(jì)算

式中:U，實(shí)際電壓，kV;d，電極板間距，0.4 cm;n，處理室個(gè)數(shù);V，處理腔體積，0.05mL;f，頻率，Hz;W，脈寬，μs;ν，流速，mL/s。

1.6.2 方波輸入能量密度計(jì)算

式中:W，方波輸入能量密度，J/cm3;t，處理時(shí)間，s;U，脈沖電壓，V;R，等效電阻，Ω;σ，溶液電導(dǎo)率，S/cm;s，處理腔面積，m2;l，處理腔間距，m;r，處理腔半徑，m。

1.6.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)至少重復(fù)2次。所得數(shù)據(jù)采用Oringin-Pro 7.5統(tǒng)計(jì)分析并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 電場(chǎng)強(qiáng)度和處理時(shí)間對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌鈍化效果的影響

當(dāng)樣品電導(dǎo)率為1.0 mS/cm，波形為單極性脈沖方波時(shí)，電場(chǎng)強(qiáng)度和處理時(shí)間對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的鈍化效果如圖2。隨著電場(chǎng)強(qiáng)度或處理時(shí)間增大，PEF對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的鈍化效果增強(qiáng)，這與 Hülsheger［8］、Pothakamury［9］和 Damar［10］等人的研究結(jié)果一致。

經(jīng)過(guò)分析，得到電場(chǎng)強(qiáng)度和處理時(shí)間對(duì)2種目標(biāo)微生物的鈍化都有極顯著影響(P＜0.01)。本研究中，在電場(chǎng)強(qiáng)度40 kV/cm、處理時(shí)間74 μs時(shí)，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別降低3.84和5.27個(gè)對(duì)數(shù)。

對(duì)不同電場(chǎng)強(qiáng)度下的鈍化效果進(jìn)行線性擬合(圖2)，可得到大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的臨界電場(chǎng)強(qiáng)度 EC分別為15.9 kV/cm 和16.4 kV/cm。Damar報(bào)道大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的EC分別為11.21～12.19 kV/cm 和 11.30 ～ 11.72 kV/cm［10］;Grahl 計(jì)算大腸桿菌的EC為11.9 ～14.2 kV/cm［11］。這種微小差異可能與處理?xiàng)l件和微生物菌株不同有關(guān)。

圖2 電場(chǎng)強(qiáng)度和處理時(shí)間對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌鈍化效果的影響

2.2 電導(dǎo)率和電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌鈍化效果的影響

電導(dǎo)率是影響PEF殺菌效果最重要的因素之一，它決定處理室的電阻，從而可能影響電場(chǎng)強(qiáng)度、脈寬、物料的溫升［12］。處理時(shí)間74 μs的單極性脈沖波形條件下，電導(dǎo)率和電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)2種目標(biāo)微生物的鈍化效果見(jiàn)圖3，PEF的鈍化效果隨電導(dǎo)率和電場(chǎng)強(qiáng)度的增大呈增強(qiáng)趨勢(shì)。但是，Alvarz［13］和 Wouters［14］等認(rèn)為，電導(dǎo)率增大會(huì)使電場(chǎng)強(qiáng)度減小從而降低PEF對(duì)微生物的鈍化效果。在外界離子濃度對(duì)微生物滲透壓影響可忽略的情況下，殺菌效果與電導(dǎo)率的關(guān)系由PEF系統(tǒng)參數(shù)、電導(dǎo)率值及其變化范圍決定。本試驗(yàn)樣品電導(dǎo)率為 1.0～2.0 mS/cm，而 Alvarez和Wouters等人的樣品電導(dǎo)率分別為2～4 mS/cm和2.7～7.9 mS/cm。電導(dǎo)率及其變化較小，其對(duì)電場(chǎng)參數(shù)的影響也小，根據(jù)方波輸入能量密度公式(見(jiàn)1.6.2)，電導(dǎo)率越大，輸入能量密度越大，PEF鈍化效果越好。反之，電導(dǎo)率及其變化較大時(shí)，電導(dǎo)率的增加會(huì)導(dǎo)致方波波形發(fā)生嚴(yán)重畸變，方波上升時(shí)間加大，相對(duì)于脈寬的影響不可忽略，故而使有效處理時(shí)間減小，從而降低PEF鈍化效果。

圖3 電導(dǎo)率和電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌鈍化效果的影響

2.3 單、雙極性脈沖對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌鈍化效果的影響

當(dāng)樣品電導(dǎo)率為1.0 mS/cm、處理時(shí)間為74 μs、電場(chǎng)強(qiáng)度為25、30和35 kV/cm時(shí)，單、雙極性脈沖對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌鈍化效果見(jiàn)圖4。同一電場(chǎng)強(qiáng)度下，2種目標(biāo)微生物對(duì)雙極性脈沖更為敏感，因?yàn)殡p極性脈沖較單極性脈沖對(duì)微生物細(xì)胞膜提供了一個(gè)額外的壓力［12］，并且由于電場(chǎng)方向的迅速反轉(zhuǎn)，使得細(xì)胞膜中帶電基團(tuán)的方向發(fā)生改變［6］。另外，雙極性脈沖還具有耗能小，可有效降低液體電解和固體在電極表面沉降等優(yōu)點(diǎn)［15］。

圖4 單、雙極性脈沖對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌鈍化效果的影響

2.4 輸入能量密度對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌鈍化效果的影響

輸入能量密度也是影響PEF對(duì)微生物鈍化效果的重要因素，它反映了電場(chǎng)強(qiáng)度、處理時(shí)間和電導(dǎo)率的綜合作用。如圖5所示，2種目標(biāo)微生物的殘活率隨輸入能量密度增大而降低，且輸入能量密度對(duì)2種目標(biāo)微生物鈍化效果的擬合曲線分別為:y=8.742× e(-x/15.128)-7.985(R2=0.910) 和 y=12.211 ×e(-x/27.026)-12.659(R2=0.913)。

同樣的輸入能量密度下，PEF對(duì)金黃色葡萄球菌的鈍化效果較對(duì)大腸桿菌的鈍化效果強(qiáng)，這個(gè)結(jié)論與Damar［10］和 Ayman［16］的不同。原因可能是:一、同種菌的不同菌株對(duì)PEF的敏感度不同［17］;二、大腸桿菌雖然細(xì)胞壁薄，但是細(xì)胞壁成分復(fù)雜，尤其是其中含有的脂多糖，蛋白質(zhì)等成分，會(huì)對(duì)細(xì)胞有一定保護(hù)作用［18］。

圖5 輸入能量密度對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌鈍化效果的影響

3 結(jié)論

隨著電場(chǎng)強(qiáng)度、處理時(shí)間的增大，PEF對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的鈍化效果增加，金黃色葡萄球菌對(duì)PEF更敏感。電場(chǎng)強(qiáng)度和處理時(shí)間均對(duì)2種目標(biāo)微生物的殘活率有極顯著影響(P＜0.01)。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的臨界電場(chǎng)強(qiáng)度EC分別為15.9 kV/cm和16.4 kV/cm。當(dāng)樣品電導(dǎo)率及其變化范圍較小時(shí)，PEF對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的鈍化效果隨電導(dǎo)率的增大而增加。雙極性脈沖比單極性脈沖對(duì)2種目標(biāo)微生物的鈍化效果好(P＜0.01)。輸入能量密度越高，PEF對(duì)兩種目標(biāo)微生物的鈍化效果越好。無(wú)冷卻處理?xiàng)l件下，PEF可使物料溫度升高2.2～30.6℃，對(duì)果汁的品質(zhì)影響需做進(jìn)一步研究。

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Inactivation of Escherichia coli and Staphylocuccus aureus in Apple Juice by Pulsed Electric Fields

Li Jing1，Xiao Jian-fu2，Chen Jie2，Liao Xiao-jun1
1(College of Food Science ＆ Natritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)2(Department of Electrical Engineering，Tsinghua University，Beijing 100084，China)

The inactivation effect of pulsed electric fields(PEF)on E.coli and S.aureus inoculated into apple juice was investigated.As increasing the electric field strength，total treatment time and electrical conductivity，the inactivation effect of E.coli and S.aureus increased.S.aureus is more sensitive to PEF than E.coli.Both the electric field strength and the total treatment time have a significant inactivation effect on E.coli and S.aureus(P ＜0.01).The critical electric field strengths of E.coli and S.aureus are 15.9 kV/cm and 16.4 kV/cm，respectively.Bipolar appears more efficient than monopolar(P ＜ 0.01).The more the energy density input，the better the inactivation effect of PEF on E.coli and S.aureus.

pulsed electric fields，apple juice，Escherichia coli，Staphylocuccus aureus

碩士研究生(廖小軍教授為通訊作者)。

*國(guó)家863項(xiàng)目—食品非熱加工技術(shù)與設(shè)備(2007AA100405)

2010-04-25，改回日期:2010-06-04