馮寶民，邱 琳，諶啟鵬，王惠國(guó)，史麗穎，蔣 革，唐 玲，王永奇，苑艷霞

中藥炮制是體現(xiàn)中醫(yī)用藥特點(diǎn)的主要內(nèi)容之一，直接關(guān)系到臨床用藥的療效。有些藥物必須進(jìn)行炮制，有效成分才能溶出，有些藥物經(jīng)炮制后，有效成分的溶出率明顯增加，因此，中藥的功效與其炮制方法有著極為密切的聯(lián)系。

白芥子為為十字花科(Cruciferae)芥屬植物白芥Sinapis alba L.的種子，辛，溫，歸肺經(jīng)，臨床入藥常以炒黃法炮制［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明:炒白芥子的鎮(zhèn)咳作用優(yōu)于生白芥子［2-3］，提示炒制法可以提高白芥子鎮(zhèn)咳藥效成分的溶出率。為明確白芥子鎮(zhèn)咳的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究前期從炒白芥子中分離得到了10個(gè)化合物，分別鑒定為4-羥基苯乙酸-2′-醛基-5′-呋喃甲酯(Ⅰ)、對(duì)羥苯基乙腈(Ⅱ)、對(duì)羥基苯甲醛(Ⅲ)、胡蘿卜苷(Ⅳ)、軟脂酸-1-單甘油酯(Ⅴ)、β-谷甾醇(Ⅵ)、芥子酸(Ⅶ)、對(duì)羥基苯甲酸(Ⅷ)、對(duì)羥基苯乙酸(Ⅸ)和雙(5-甲?；坊?醚(Ⅹ)［4］。HPLC 研究結(jié)果顯示，上述成分中，對(duì)羥基苯乙腈含量在炒制后明顯增加。對(duì)羥基苯乙腈的氰基結(jié)構(gòu)可能在體內(nèi)經(jīng)過Ⅰ相酶系的作用產(chǎn)生氰化氫(HCN)，從而起到中樞鎮(zhèn)咳作用［5］，因此，本研究擬分離純化對(duì)羥基苯乙腈并對(duì)其鎮(zhèn)咳作用進(jìn)行研究，為白芥子炮制機(jī)制及白芥子鎮(zhèn)咳活性成分的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

XT4A顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀，JEOL JNM-AL400型、Bruker ARX-500型核磁共振儀，JEOL JMS-700型質(zhì)譜儀，Waters 515高效液相色譜儀，Waters 2487 Dual λ紫外檢測(cè)器，Chromstation數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，BP210s 1/1萬電子天平(Sartorius公司)，BP211s 1/10萬電子天平(Sartorius公司)，Laborato 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph公司)，秒表(深圳追日電子公司)。

白芥子購(gòu)自河北安國(guó)，經(jīng)大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院高松副教授鑒定為十字花科植物白芥Sinapis alba L.的干燥成熟種子。氨水(安徽宿州化學(xué)試劑廠)，10～40 μm薄層色譜用硅膠、200～300目柱色譜用硅膠(青島海洋化工廠)。

昆明種小白鼠，♀♂各半，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 方法

2.1 炒制前后白芥子中對(duì)羥基苯乙腈含量的比較

炒白芥子的制備:取凈白芥子，分別用文火加熱5、10 min，炒至表面呈黃色，有爆裂聲，并放出香辣氣味，取出，放涼。

色譜柱條件:色譜柱為L(zhǎng)una 5u Pheny1-Hexy1(250 mm ×4.60 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇 -水(35∶65，V/V)流速0.6 ml·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)287 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密稱取對(duì)羥基苯乙腈對(duì)照品加甲醇溶解并定容至質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50 mg·L-1的溶液。精密吸取各溶液 10 μl，注入液相色譜儀，測(cè)得進(jìn)樣濃度(X)對(duì)峰面積(Y)的直線回歸方程。

供試品溶液的制備:取生白芥子與5 min炒白芥子、10 min炒白芥子，各20 g，粉碎，石油醚脫脂，過濾，藥渣用0.95乙醇回流提取3次，合并提取液;濃縮至無醇味，得其浸膏，分別精密稱取樣品的浸膏0.1 g，加甲醇溶解并定容至50 ml，得濃度為2 g·L-1的溶液，備用。

樣品測(cè)定:分別精密吸取各供試品溶液10 μl，注入液相色譜儀，按上述條件測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求出含量。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的篩選及引咳實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物篩選:將小鼠放入倒置的燒杯內(nèi)，迅速放入注有1.0 ml濃氨水的棉球，5 s后立即取出，2 min內(nèi)不咳嗽者舍去。

引咳實(shí)驗(yàn):在篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)束7 d后，隨機(jī)分組，給藥結(jié)束后，將小鼠放在倒置的600 ml的燒杯內(nèi)，迅速放入注有1.0 ml濃氨水的棉球，一熏一換氨水球，每次熏1只小鼠。記錄放入時(shí)間，觀察并記錄咳嗽潛伏期，并記錄2 min內(nèi)小鼠的咳嗽次數(shù)。

2.3 白芥子炒制前后鎮(zhèn)咳作用比較 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌胃給藥。分組及給藥劑量如下:A陰性對(duì)照組(蒸餾水0.5 ml·d-1)、B生白芥子組(含4.500 g·kg-1·d-1生白芥子生藥醇提液)、C炒白芥子組(含4.500 g·kg-1·d-1炒白芥子生藥的醇提液)。各組小鼠連續(xù)灌胃給藥7 d，在d 7給藥30 min后，參照“2.2”進(jìn)行引咳實(shí)驗(yàn)。

2.4 對(duì)羥基苯乙腈的制備 取炒白芥子5.0 kg，粉碎，用石油醚(60℃ ～90℃)室溫冷浸脫脂3次(每次24 h)，晾干，以0.95乙醇回流提取，合并提取液，減壓回收乙醇至無醇味，得浸膏733 g;該浸膏加入7 L蒸餾水溶解分散后，依次用1/3體積的醋酸乙酯萃取4次，回收溶劑，得醋酸乙酯萃取物200 g，經(jīng)多次柱色譜分離及重結(jié)晶得到對(duì)羥基苯乙腈化合物。

2.5 對(duì)羥基苯乙腈鎮(zhèn)咳作用研究 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌胃給藥。分組及給藥劑量如Tab 3:A炒白芥子組(含4.500 g·kg-1·d-1炒白芥子生藥的醇提液，其中含對(duì)羥基苯乙腈0.022 5 g·kg-1·d-1)，B對(duì)羥基苯乙腈低劑量組，C對(duì)羥基苯乙腈中劑量組，D對(duì)羥基苯乙腈高劑量組。在d 7給藥30 min后，參照“2.2”進(jìn)行引咳實(shí)驗(yàn)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)用SPSS 10.0軟件處理，首先進(jìn)行正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，但方差不齊，故采用近似t檢驗(yàn)，即 t′檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 炒制前后白芥子中對(duì)羥基苯乙腈含量的變化

進(jìn)樣濃度(X)對(duì)峰面積(Y)的直線回歸方程為^Y=5.841×103X+3.573×103，r=0.999 6;線性范圍0.5～2.5 mg。由Tab 1可見白芥子中對(duì)羥基苯乙腈含量隨著炒制時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。白芥子炒制5 min后，其中對(duì)羥基苯乙腈的含量是生白芥子的5.5倍，白芥子炒制10 min后其中對(duì)羥基苯乙腈的含量是生白芥子的7.5倍。

Tab 1 Comparison of p-hydroxyphenylacetonitrile content between fresh and roasted sinapis alba seeds

3.2 炒白芥子與生白芥子鎮(zhèn)咳作用比較 如Tab 2所示，與陰性對(duì)照組相比，生白芥子能夠延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的咳嗽潛伏期，但抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)作用不明顯;炒白芥子具有明確的鎮(zhèn)咳作用。與生白芥子相比，相同劑量情況下，炒白芥子延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物咳嗽潛伏期、抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)的效果均優(yōu)于生白芥子，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

Tab 2 Comparision of antitussive action between fresh and roasted sinapis alba seeds±s，n=20)

Tab 2 Comparision of antitussive action between fresh and roasted sinapis alba seeds±s，n=20)

*P＜0.05 vs negative control group;#P＜0.05 vs fresh seeds of sinapis alba group

Group Dose/g·kg-1·d-1 Cough latent period/s Cough times in 2min A Negative - 6.229±2.274 27.357±9.312 B Fresh sinapis alba seeds 4.500 14.243±3.471* 23.125±8.413 C Roasted sinapis alba seeds 4.500 25.774±6.903*#15.800±3.942*#

3.3 對(duì)羥基苯乙腈的制備 200 g醋酸乙酯萃取物經(jīng)多次柱色譜分離及重結(jié)晶得到無色棱柱狀結(jié)晶，mp 66℃ ～ 67℃ (氯仿)。EI-MS m/z:133［M+］，132，106，105，78，77，51，50，39。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.15(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.83(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，5.87(1H，brs，-OH)，3.62(2H，s，H-2)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ:155.4(C-4′)，129.1(C-2′，6′)，121.3(C-1′)，118.2(-CN)，115.9(C-3′，5′)，22.9(C-2)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻(xiàn)［6］及 Sadtler光譜［7］中對(duì)羥基苯乙腈對(duì)照基本一致，故鑒定其為對(duì)羥基苯乙腈。

3.4 對(duì)羥基苯乙腈鎮(zhèn)咳作用研究 由Tab 3可知，與陰性對(duì)照A組相比，對(duì)羥基苯乙腈具有明確的鎮(zhèn)咳作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與B炒白芥子組相比，對(duì)羥基苯乙腈的低劑量組與炒白芥子鎮(zhèn)咳效果相當(dāng)，對(duì)羥基苯乙腈的中劑量組，其抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)效果優(yōu)于炒白芥子，對(duì)羥基苯乙腈的高劑量組，其延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物引喘潛伏期、抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)作用均優(yōu)于炒白芥子。

Tab 3 The antitussive effect of p-hydroxyphenylacetonitrile(n=6)

4 討論

中藥炮制工藝是中醫(yī)臨床用藥的一大特色。中藥在炮制過程中發(fā)生了某些成分的變化，因而導(dǎo)致其藥理活性的變化。研究中藥材的炮效關(guān)系對(duì)于分析中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有一定的指導(dǎo)意義。

白芥子臨床入藥以炒制法為主，本研究結(jié)果顯示，炒白芥子鎮(zhèn)咳活性明顯優(yōu)于生白芥子，這說明炒制法可以提高白芥子中鎮(zhèn)咳藥效成分含量。我們對(duì)炒白芥子和生白芥子的化學(xué)成分進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果顯示，炒制后對(duì)羥基苯乙腈含量明顯增加，白芥子炒制10 min后，其中對(duì)羥基苯乙腈含量是炒制前的7.5倍。依據(jù)炮效關(guān)系進(jìn)行分析，對(duì)羥基苯乙腈很可能是白芥子鎮(zhèn)咳的藥效成分，本研究在此基礎(chǔ)上，分離純化出對(duì)羥基苯乙腈并對(duì)其鎮(zhèn)咳作用進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)羥基苯乙腈具有明確的鎮(zhèn)咳作用，其延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物咳嗽潛伏期、抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)效果明顯優(yōu)于空白對(duì)照組，可以確定對(duì)羥基苯乙腈為白芥子鎮(zhèn)咳藥效成分。對(duì)羥基苯乙腈在延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物咳嗽潛伏期方面具有一定的量效關(guān)系，中劑量的對(duì)羥基苯乙腈抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)作用效果優(yōu)于炒白芥子。高劑量的對(duì)羥基苯乙腈鎮(zhèn)咳效果尤為明顯，其延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物咳嗽潛伏期、抑制2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)效果均優(yōu)于炒白芥子，組間差異有顯著性(P＜0.05)。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典Ⅰ部［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:110.

［1］China Pharmacopoeia Committee.Chinese Pharmacopeiachp PartⅠ［S］.Beijing:Chemical Industry Publisher，2005:110.

［2］張學(xué)梅，劉凡亮，梁文波，等.白芥子提取物的鎮(zhèn)咳、祛痰及平喘作用研究［J］.中草藥，2003，34(7):635-7.

［2］Zhang X M，Liu F L，Liang W B，et al.Antitussive，expectorant and antiasthmatic effects of Brassica alba extracts［J］.Chin Tradit Herb Drugs，2003，34(7):635-7.

［3］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.上海:上海人民出版社，1977:716.

［3］Jiangsu New Medical College.Dictionary of Traditional Chinese Medicine［M］.Shanghai:Shanghai People Press，1977:716.

［4］馮寶民，余正江，段禮新，等.炒白芥子中化學(xué)成分的研究［J］.天津:中草藥，2008，39(3):331-3.

［4］Feng B M，Yu Z J，Duang L X，et al.Chemical constituents of roasted sinapis seeds［J］.Tianjin:Chin Tradit Herbal Drugs，2008，39(3):331-3.

［5］羅集鵬.生藥學(xué)［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2005:336.

［5］Luo J P.Pharmacognosy［M］.Beijing:Chinese Medicine Science and Technology Press，2005:336.

［6］呂秋軍.新藥藥理學(xué)研究方法［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007:334-6.

［6］Lü Q J.Methodology of new drug research in pharmacology［M］.Beijing:Chemical Industry Publisher，2007:334-6.