張乃菊，陳天平，董淑英，張?jiān)铝?，李筱俊，余美玲，祝曉?/p>

信號(hào)傳導(dǎo)通路在細(xì)胞分化、增殖與凋亡中起著重要作用。ERK1/2是受外界刺激時(shí)決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵因素，ERK1/2的活化是將信號(hào)從細(xì)胞表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞核的關(guān)鍵步驟，ERK1/2在刺激中被激活，同時(shí)其持續(xù)活化最終促進(jìn)細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化。目前，賴氨匹林(即阿司匹林與賴氨酸的復(fù)鹽，主要成分為阿司匹林)對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的抑制作用是否與ERK信號(hào)通路有關(guān)尚不明確。本實(shí)驗(yàn)旨在研究aspisol對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞株ERK1/2、PERK1/2和COX-2蛋白表達(dá)的影響，初步探討aspisol在體外對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人宮頸癌HeLa細(xì)胞株引自美國模式菌種保藏中心(ATCC)，由本實(shí)驗(yàn)室保種。

1.2 藥品和試劑 aspisol購于安徽豐原藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)081106;DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶:Gibco公司;胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)購于杭州四季青公司;Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購于晶美生物工程有限公司;山羊抗小鼠IgG、辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG-HRP:中杉金橋生物技術(shù)有限公司;兔ERK-1、ERK-2多克隆抗體、小鼠P-ERK單克隆抗體、小鼠抗人GAPDH單克隆抗體、山羊COX-2多克隆抗體、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和Western blot熒光試劑:Santa Cruz公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌HeLa細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于低糖DMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為0.10 FCS，20 mmol·L－1Hepes，2.0 g·L－1碳酸氫鈉，1 ×105U·L－1青霉素和 10 mg·L－1鏈霉素)，置 37℃、0.05 CO2、0.90相對(duì)濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為5組:陰性對(duì)照組只加等體積的低糖DMEM培養(yǎng)液的HeLa細(xì)胞;實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的aspisol，使其終濃度分別為1、5、10 mmol·L－1;陽性藥組加入 ERK1/2 抑制劑U0126，使其終濃度為 10 μmol·L－1。

1.4 MTT法檢測(cè)aspisol對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，按2×107·L－1接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔接種200 μl，用含0.10小牛血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，用無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后采用不同的給藥方案(同“1.3”)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，加藥處理后的24、48、72 h 加入20 μl 5 g·L－1的 MTT 溶液。繼續(xù)孵育4 h后，仔細(xì)吸去上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，于微量震蕩器上輕輕震蕩以使甲臢完全溶解，30 min后在492 nm波長(zhǎng)處用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)吸光度值(A492)。根據(jù)公式計(jì)算不同濃度藥物對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(1－實(shí)驗(yàn)組 A492值/陰性對(duì)照組 A492值)×100%［1］。

1.5 細(xì)胞增殖能力測(cè)定 采用Dr.Glazer報(bào)道的“標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞集落形成分析法”［2］測(cè)定aspisol對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞集落(克隆)形成的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞按1×108·L－1將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接種到6孔板，每孔2 ml，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h加藥(給藥方案同“1.3”)，共同孵育1 h后經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化制備成單個(gè)細(xì)胞懸液，接種于6孔板，每孔1 000個(gè)細(xì)胞，置于37℃、0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)7 d，出現(xiàn)肉眼可見的克隆。常規(guī)吉姆薩染色，干燥后鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

細(xì)胞集落形成率/%=各組細(xì)胞集落數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞集落數(shù)×100%。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HeLa細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞以1×108·L－1接種于6孔板中，每孔2 ml，待細(xì)胞貼壁后加入無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，換新鮮培養(yǎng)液采用不同的給藥方案(同1.3)，藥物作用24 h后收集細(xì)胞。用4℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞兩次，取250 μl結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，并使其濃度為1 ×109·L－1;取100 μl的細(xì)胞懸液于5 ml流式管中，加入5 μl Annexin V/FITC 和10 μl 20 mg·L－1的碘化丙啶溶液，混勻后于室溫避光溫育15 min。在反應(yīng)管中加400 μl PBS，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)，結(jié)果采用Winmdi 2.9軟件分析處理。

1.7 Western blot法檢測(cè) HeLa細(xì)胞 ERK、PERK、COX-2的表達(dá) 常規(guī)收集不同的給藥方案(同1.3)作用24 h后的宮頸癌HeLa細(xì)胞，加入冰預(yù)冷的細(xì)胞裂解液 (總體積200 ml:100 mmol·L－1Tris-HCl pH 7.4 20 ml、1 mol·L－1NaCl 28 ml、100 mmol·L－1CaCl21 ml、100 mmol·L－1MgCl221 ml、15 mmol·L－1NaN340 ml、Triton X-100 2 ml，用前加入蛋白酶抑制劑 12 μmol·L－1Leupeptin、1 mmol·L－1PMSF 各 2 ml·L－1)冰上裂解 30 min，提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量法測(cè)定細(xì)胞提取物的蛋白濃度。用細(xì)胞裂解液將各組蛋白稀釋至等濃度，與2×上樣緩沖液1∶1混合，100℃煮沸5 min蛋白變性。取蛋白每組40 μg，10%SDS-PAGE凝膠電泳(70 V，30 min，100 V，90 min);轉(zhuǎn)膜(200 mA，3h)至PVDF膜;50 g·L－1脫脂牛奶室溫封閉2 h(或4℃過夜);一抗:1∶500，室溫孵育2 h(或4℃過夜);TPBS洗滌3次，PBS洗滌1次;二抗:1∶7 000，室溫孵育2 h;TPBS洗滌3次，PBS洗滌1次;將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合;1 min后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸;1 min后，將膜移至另一保鮮膜上，放入凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描和拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。

2 結(jié)果

2.1 Aspisol對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用 隨著濃度的增加，aspisol對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制率明顯增加(P＜0.01);每一個(gè)濃度的aspisol對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。1 mmol·L－1的aspisol就能對(duì)HeLa細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，10 mmol·L－1的aspisol抑制作用在72 h后達(dá)到(59.1±4.7)%，見 Fig 1。

Fig 1 The inhibitory effects of aspisol on the proliferation of HeLa cells( ± s，n=6)*P ＜0.05 vs aspisol 1 mmol·L－1group

2.2 Aspisol對(duì)HeLa細(xì)胞集落形成的影響 以細(xì)胞集落形成率的降低作為aspisol的細(xì)胞毒性指標(biāo)。我們按照每孔1000個(gè)的細(xì)胞濃度將HeLa細(xì)胞接種到6孔板中。7 d后出現(xiàn)肉眼可見的集落。集落形成數(shù)量在 1、5、10 mmol·L－1aspisol處理的情況下與陰性對(duì)照組相比分別降低到(96.22±0.18)%、(73.02±1.35)%、(48.17±2.05)%;U0126 10 μmol·L－1與陰性對(duì)照組相比降低到(61.27±1.25)%。aspisol(l mmol·L－1)與陰性對(duì)照組比較，差異無顯著性(P ＞0.05)，aspisol(5、10 mmol·L－1)和10 μmol·L－1U0126 與陰性對(duì)照組比較，差異有顯著性(P＜0.05)，提示aspisol有一定的毒性作用。

2.3 Aspisol對(duì) HeLa細(xì)胞凋亡的影響 1、5、10 mmol·L－1aspisol和 10 μmol·L－1U0126 分別作用于HeLa細(xì)胞24 h后細(xì)胞凋亡率分別為(5.74±0.87)%、(13.01±1.85)%、(23.42±3.12)%和(19.22±2.86)%，與陰性對(duì)照組(0.46±0.19)%相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.4 Western blot法檢測(cè) aspisol對(duì) HeLa細(xì)胞ERK、P-ERK、COX-2蛋白表達(dá)的影響 各組HeLa細(xì)胞均有兩條條帶(磷酸化ERK1/2和總ERK1/2)，上面一條帶為44 ku的ERK1(p44)，下面一條帶為 42 ku的 ERK2(p42)，磷酸化 ERK1/2是ERK1/2的活性形式。與對(duì)照組相比，陽性藥10 μmol·L－1的U0126 作用于HeLa細(xì)胞24 h后，能夠下調(diào)P-ERK1/2的表達(dá)(P＜0.01);實(shí)驗(yàn)組不同濃度aspisol作用于HeLa細(xì)胞24 h后，磷酸化ERK1/2逐漸減少(P＜0.01)。這表明 aspisol抑制了ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)通路，且隨著aspisol作用濃度的增加，P-ERK1/2蛋白表達(dá)逐漸降低，呈現(xiàn)濃度依賴的趨勢(shì)，但總ERK1/2蛋白表達(dá)水平不變。

COX-2蛋白分子量為72 ku，免疫雜交后在72 ku位置出現(xiàn)陽性條帶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，陽性藥 U0126 10 μmol·L－1作用于 HeLa 細(xì)胞后，能夠下調(diào)COX-2的表達(dá)(P＜0.01);實(shí)驗(yàn)組隨著aspisol濃度的逐漸增加，COX-2表達(dá)水平逐漸降低(P＜0.01)。內(nèi)參GAPDH蛋白(分子量為37 ku)表達(dá)水平不變，見Fig 2、3。

Fig 2 The expression of the ERK and p-ERK proteins in HeLa cells after exposure to aspisol for 24 h( ± s，n=3)A:Control group;B:Aspisol 1 mmol·L －1;C:Aspisol 5 mmol·L －1;D:Aspisol 10 mmol·L －1;E:U0126 10 μmol·L －1

Fig 3 The expression of the COX-2 proteins in HeLa cells after exposure to aspisol for 24 h(±s，n=3)A:Control group;B:Aspisol 1 mmol·L －1;C:Aspisol 5 mmol·L －1;D:Aspisol 10 mmol·L －1;E:U0126 10 μmol·L －1

3 討論

非甾體抗炎藥抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)主要通過兩種途徑發(fā)揮作用，即抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡，如aspisol通過抑制Survivin、C-erbB-2的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖［3］。筆者通過 MTT、細(xì)胞集落形成、流式細(xì)胞儀等實(shí)驗(yàn)證實(shí)aspisol能夠有效抑制HeLa細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡，且隨著濃度的增加，抑制率和凋亡率均上升。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2通路的激活在細(xì)胞增殖失控引起的腫瘤發(fā)生中起重要作用。在人結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌和肺癌等多種腫瘤中，均可檢測(cè)到ERK表達(dá)水平增高。因此推測(cè)，抑制ERK1/2的激活將可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的敏感性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在宮頸癌HeLa細(xì)胞中ERK1/2表達(dá)增多，陽性藥ERK通路選擇性抑制劑U0126能夠明顯下調(diào)P-ERK1/2的表達(dá);實(shí)驗(yàn)組aspisol可呈濃度依賴性抑制 HeLa細(xì)胞中磷酸化ERK1/2的表達(dá)，但不影響總ERK1/2的表達(dá)。因此，ERK1/2活性抑制可能是aspisol抑制HeLa細(xì)胞的分子機(jī)制之一。這與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［4－5］。正常的生理狀態(tài)下COX-2幾乎不表達(dá)或表達(dá)甚少，而在癌前病變組織和癌變組織中，COX-2的水平都有上升。COX-2可能是通過影響細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖及分化、抑制細(xì)胞凋亡、增加腫瘤侵襲力等達(dá)到致癌的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:HeLa細(xì)胞COX-2表達(dá)增高，aspisol呈濃度依賴性抑制COX-2的表達(dá);ERK通路選擇性抑制劑U0126 10 μmol·L－1作用于 HeLa 細(xì)胞后，能夠下調(diào)COX-2的表達(dá)，這與劉冬妍等［6］結(jié)果一致，這表明COX-2表達(dá)可能由MAPK家族的一個(gè)成員ERK途徑調(diào)控。

綜上所述，aspisol可能是通過抑制HeLa細(xì)胞ERK1/2的磷酸化進(jìn)而下調(diào)COX-2的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而達(dá)到治療宮頸癌的目的，但ERK1/2-MAPK信號(hào)通路與COX-2途徑之間具體的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)控機(jī)制仍不完全清楚。有文獻(xiàn)報(bào)道［7］在腫瘤細(xì)胞中存在著這樣的通路:蛋白激酶C→MAPK→AP-1→COX-2，AP-1的激活可促使COX-2的表達(dá)，但aspisol是否通過上述通路還有待于更深入的研究。

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