隋海娟，金 英，潘月星，劉婉珠，閆恩志

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫吞噬細(xì)胞，在致炎因素作用下被激活成反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞。激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞具有吞噬功能，并增加分泌細(xì)胞因子如白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)及 NO 等，這些物質(zhì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有毒性作用，使神經(jīng)細(xì)胞凋亡并壞死［1，2］。同時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)中又起支持并維護(hù)腦神經(jīng)元突觸聯(lián)系的正常功能，它的損傷常導(dǎo)致腦組織正常結(jié)構(gòu)和功能的改變，最終導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變的發(fā)生。已有研究表明阿爾采末(Alzheimer′s disease，AD)患者腦內(nèi)伴有明顯膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)，斑塊周圍出現(xiàn)大量星形膠質(zhì)細(xì)胞，激活星形膠質(zhì)細(xì)胞在老年斑的形成中起到重要作用。

過(guò)氧化物酶增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receotor-γ，PPARγ)激動(dòng)劑噻唑烷二酮類藥物(thiazolidinedione drugs，TZDs)作為胰島素增敏劑目前在臨床主要用于2型糖尿病和胰島素抵抗的治療。研究表明［3-4］吡格列酮(pioglitazone，Pio)可能通過(guò)上調(diào)脂聯(lián)素受體(Adipo R1)或增加visfatin蛋白表達(dá)而改善胰島素抵抗。除了調(diào)節(jié)糖代謝，這類藥物還能抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活及中樞炎癥介質(zhì)的分泌［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)TZDs對(duì)神經(jīng)細(xì)胞還有直接的保護(hù)作用，但其保護(hù)作用機(jī)制研究尚不全面。新近國(guó)外研究［7］又提出了TZDs通過(guò)激活PPARγ來(lái)抑制沉積作用的新理論。本研究采用LPS損傷模型，觀察吡格列酮對(duì)培養(yǎng)的大鼠乳鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子和NO的影響，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 1～2 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠［動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(遼)2003-0007］，遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥品和試劑 吡格列酮由日本Takeda公司提供 (批號(hào):060901，純度＞99%)，臨用時(shí)用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解。DMSO、LPS、DMEM、胰蛋白酶(trypsin，1 ∶250)、L-多聚賴氨酸(poly-L-lysine)、GFAP單克隆抗體均購(gòu)自Sigma公司;PPARγ受體特異性阻斷劑GW9662和JNK特異性阻斷劑SP600125購(gòu)于廈門勵(lì)遠(yuǎn)有限公司;選擇性誘導(dǎo)型一氧化氮合酶阻斷劑SMT和NO檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所;新生胎牛血清、HEPES、馬血清購(gòu)于北京華美轉(zhuǎn)導(dǎo)科技有限公司;IL-1β、IL-6及TNF-α的ELISA試劑盒為武漢博士德生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 儀器與器材 CO2培養(yǎng)箱(TEHER)、倒置顯微鏡(PM-6 Olympus)為日本產(chǎn)品;離心沉淀器(800型)為上海產(chǎn)品;水浴恒溫振蕩器為武漢產(chǎn)品;Mini-REPOTEANⅡ 電泳槽為Bio-Red公司產(chǎn)品;TGL-16G高速冷凍離心機(jī)為日本日立公司產(chǎn)品;DYY-Ⅲ型電轉(zhuǎn)移槽為北京六一儀器廠產(chǎn)品;Biocell2010酶標(biāo)儀為Anthos Labtec Instruments公司產(chǎn)品;低溫冰箱為日本三洋公司產(chǎn)品;免疫熒光顯微鏡(ZDM-500Z)產(chǎn)于德國(guó)。

2 方法

2.1 大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 取出生1～2 d的SD大鼠乳鼠，體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇浸泡消毒，無(wú)菌條件下取出大腦皮層，置于培養(yǎng)基中，剔除血管和軟腦膜，剪成1 mm3左右的小塊。加入0.125%胰蛋白酶37℃消化10 min。待細(xì)胞分散后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。200目篩網(wǎng)過(guò)濾，1 000×g離心10 min，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108·L-1～1×109·L-1，接種在鋪有L-多聚賴氨酸75 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以后每3 d換液1次，d 9將培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞置于水浴恒溫振蕩器上，37℃、260 r·min-1、2 h，移除上層液體，去除貼壁不牢固的小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。仍貼壁的細(xì)胞大部分為星形膠質(zhì)細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶溶液消化后離心，完全培養(yǎng)基重懸，接種于兩個(gè)75 cm2培養(yǎng)瓶中，傳2～3代后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用GFAP染色以鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞純度，結(jié)果表明星形膠質(zhì)細(xì)胞純度在95%以上(Fig 1)。

Fig 1 The expression of GFAP in cultured cortical astrocytes in rats(×400).

2.2 ELISA 方法測(cè)定 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 表達(dá)水平 星形膠質(zhì)細(xì)胞傳2～3代后進(jìn)行分組，藥物處理后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，1 500 r·min-1，4℃，離心10 min，分裝，-80℃凍存。取上清，根據(jù)IL-1β、IL-6和TNF-α檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書所示的操作方法，用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品在450 nm的吸光度值(A450值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，直線回歸分析，得出其直線回歸方程。將測(cè)得的不同待檢標(biāo)本的A值代入相應(yīng)的直線回歸方程中，即可得到IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量的測(cè)定 星形膠質(zhì)細(xì)胞傳2～3代后進(jìn)行分組，藥物處理后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，1 500 r·min-1，4℃，離心 10 min，分裝，-80℃凍存。取上清，根據(jù)Griess法測(cè)定培養(yǎng)液中NO的含量［8］。具體測(cè)定方法按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用表示，采用oneway ANOVA和LSD’s post hoc test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 結(jié)果

3.1 吡格列酮對(duì)抗LPS引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β、IL-6和TNF-α釋放增加 Tab 1，2結(jié)果顯示，加入LPS作用后星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6及TNF-α含量開(kāi)始增加，24 h達(dá)高峰，48 h后開(kāi)始降低。Pio(0.1 μmol·L-1)組可降低星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β的表達(dá)水平 (P＜0.05)，也可明顯抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-6的分泌(P＜0.01)，而對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌 TNF-α 則無(wú)作用。Pio(1、10 μmol·L-1)組均能明顯抑制LPS引起的IL-1β、IL-6和TNF-α的水平增加，并呈一定濃度依賴性(Tab 2)。GW9662(10 μmol·L-1)能夠明顯對(duì)抗吡格列酮對(duì)LPS引起的 IL-1β、IL-6和 TNF-α 增加的抑制作用。SP600125可對(duì)抗 LPS引起的 IL-1β、IL-6和 TNF-α產(chǎn)生增加，單獨(dú)應(yīng)用SP600125對(duì)正常IL-1β、IL-6和TNF-α 無(wú)作用(Tab 2)。

Tab 1 Effect of LPS on the level of IL-1β，IL-6 and TNF-α in cultured medium of astrocytes in rats(±s，n=5)

Tab 1 Effect of LPS on the level of IL-1β，IL-6 and TNF-α in cultured medium of astrocytes in rats(±s，n=5)

Cultured astrocytes were incubated with 10 mg·L-1LPS for 1，2，4，8，16，24，and 48 h.After the incubation with LPS，the culture medium was collected.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control

Group IL-1β level/ng·L-1 IL-6 level/μg·L-1 TNF-α level/ng·L -1 Control 6.59±1.06 1.82±0.21 2.03±0.19 LPS 1 h 7.09±0.98 2.23±0.36 2.84±0.47 LPS 2 h 15.16±3.57* 4.09±0.18* 4.36±0.77*LPS 4 h 43.67±5.18＊＊ 6.54±0.52＊＊ 7.52±0.52＊＊LPS 8 h 80.56±6.47＊＊ 8.13±0.64＊＊ 9.53±0.82＊＊LPS 16 h 126.49±7.38＊＊ 9.67±0.57＊＊11.76±0.61＊＊LPS 24 h 163.46±7.81＊＊13.46±1.59＊＊14.53±1.16＊＊LPS 48 h 135.62±6.43＊＊10.89±0.73＊＊12.09±0.94＊＊

Tab 2 Inhibitory effect of pioglitazone on IL-1β，IL-6 and TNF-α production in cultured astrocytes in rats(±s，n=5)

Tab 2 Inhibitory effect of pioglitazone on IL-1β，IL-6 and TNF-α production in cultured astrocytes in rats(±s，n=5)

＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS.▲▲P ＜0.01 vs LPS+Pio 1 μmol·L-1.

Group IL-1β level/ng·L-1 IL-6 level/μg·L-1 TNF-α level/ng·L -1 Control 6.85±1.17 1.76±0.20 1.91± 0.23 LPS 158.99±8.20＊＊ 11.80±1.72＊＊12.42±1.48＊＊LPS+Pio/μmol·L-1 0.1 136.44±10.82# 6.72±0.85 11.15±0.97##1 104.71±12.91## 3.10±0.91## 3.06±0.77##10 97.68±5.94## 2.07±0.62## 1.82±0.52##LPS+Pio 1 μmol·L-1+GW 149.56±9.48▲▲ 10.76±1.24▲▲ 11.83±1.05▲▲GW 9662 6.29±0.95 1.56±0.19 2.03±0.18 LPS+SP 50.68±5.73## 3.47±0.58## 4.85±0.47##SP600125 6.57±1.05 1.64±0.22 1.88±0.21

3.2 吡格列酮對(duì)LPS引起體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞NO含量的影響 從Fig 2和Tab 3可以看出，加入LPS作用后星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量開(kāi)始增加，24 h達(dá)高峰，48 h NO含量開(kāi)始降低。吡格列酮(0.1、1 和 10 μmol·L-1)可明顯抑制 LPS 引起的NO含量增加，呈明顯濃度依賴性。而吡格列酮(0.1 μmol·L-1)部分抑制LPS引起的NO含量增加，未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

GW9662(10 μmol·L-1)能夠明顯對(duì)抗吡格列酮對(duì)LPS引起的NO增加的抑制作用。SMT(1.0 mmol·L-1)幾乎完全對(duì)抗LPS誘導(dǎo)NO產(chǎn)生的增加，單獨(dú)應(yīng)用SMT對(duì)正常培養(yǎng)NO產(chǎn)生有輕微的抑制作用，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SP600125可對(duì)抗LPS引起的NO產(chǎn)生增加，單獨(dú)應(yīng)用SP600125對(duì)正常NO無(wú)作用(Tab 3)。

Fig 2 Effect of LPS on the content of NO in cultured medium of astrocytes in rats±s，n=5)

Tab 3 Effect of pioglitazone on the content of NO in cultured medium of astrocytes in rats(±s，n=5)

Tab 3 Effect of pioglitazone on the content of NO in cultured medium of astrocytes in rats(±s，n=5)

＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs LPS;▲▲P＜0.01 vs LPS+Pio1 μmol·L-1

Group Dose/μmol·L-1 NO content/μmol·L -1 Control 5.44±0.24 LPS 15.08±1.24＊＊LPS+Pio 0.1 13.81±1.06 LPS+Pio 1 7.67±0.64##LPS+Pio 10 6.54±0.93##LPS+Pio 1+GW 10 15.70±0.84▲▲GW9662 10 5.62±0.47 LPS+SMT 103 6.69±0.54##SMT 103 5.01±0.35 LPS+SP 5 7.97±0.98#SP600125 5 5.34±0.31

4 討論

AD的關(guān)鍵性特征之一是腦內(nèi)炎癥。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥環(huán)境下，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞共同承擔(dān)著免疫細(xì)胞的角色，尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞，在很多腦部疾病中通過(guò)產(chǎn)生和釋放有害的促炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子如NO、IL-1β、IL-6及TNF-α等來(lái)啟動(dòng)和促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)展［9］，從而引起神經(jīng)細(xì)胞損傷。PPARγ 激活能明顯抑制炎癥反應(yīng)［10］，如 Combs等［11］發(fā)現(xiàn)PPARγ激活可明顯抑制Aβ引起的培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和炎癥細(xì)胞因子的釋放。本研究發(fā)現(xiàn)LPS可增加星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6及TNF-α，吡格列酮能夠明顯抑制LPS的這些作用。說(shuō)明吡格列酮對(duì)LPS引起的IL-1β、IL-6和 TNF-α增加的抑制作用是通過(guò)激活PPARγ而產(chǎn)生其抑制作用的。JNK特異性阻斷劑 SP600125(5 μmol·L-1)亦能有效對(duì)抗LPS誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α及NO分泌的增加。說(shuō)明吡格列酮對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用可能與抑制JNK信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)。最新研究還表明［12］，IL-1可通過(guò)JNK信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)介導(dǎo)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 (inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表達(dá)。吡格列酮抑制JNK激活可能是產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制之一。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)吡格列酮通過(guò)抑制JNK信號(hào)傳導(dǎo)通路保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞凋亡［13-14］，也進(jìn)一步支持了這一結(jié)果。

激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞大量表達(dá)iNOS，產(chǎn)生大量的 NO［15-16］。Pang 等［17］研究發(fā)現(xiàn)NO的產(chǎn)生和iNOS的表達(dá)與JNK通路有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)加入LPS后其NO分泌增加，而吡格列酮能明顯的抑制LPS誘導(dǎo)的NO的產(chǎn)生，抑制神經(jīng)細(xì)胞損傷，SMT幾乎完全對(duì)抗LPS誘導(dǎo)NO產(chǎn)生的增加。吡格列酮的這種作用可能是通過(guò)抑制JNK通路進(jìn)一步抑制iNOS，從而使NO產(chǎn)生降低，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。吡格列酮是噻唑烷二酮類(Thiazolidinedione drugs，TZDs)化合物的一種，是PPARγ受體有效的激動(dòng)劑。故認(rèn)為吡格列酮對(duì)LPS致星形膠質(zhì)細(xì)胞的損害可能與其激活PPARγ及抑制JNK通路進(jìn)一步抑制 iNOS，減少了 IL-1β、IL-6、TNF-α 及 NO 的生成有關(guān)。

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