侯 微，袁恒杰，溫 克，吳艷娜，婁建石

肢體缺血預(yù)適應(yīng)(limb ischemic preconditioning，LIP)是指反復(fù)短暫的肢體缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)對(duì)其他組織器官(如心臟、腦等［1－5］)的長(zhǎng)時(shí)間I/R損傷具有保護(hù)作用。與心臟原位缺血預(yù)適應(yīng)比較，LIP具有方便可行的優(yōu)勢(shì)，具有更大的臨床應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，連續(xù)3 d的LIP可提供與心臟原位缺血預(yù)適應(yīng)強(qiáng)度相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)作用［6］，且能改善長(zhǎng)時(shí)間心肌I/R造成纖溶系統(tǒng)失衡狀態(tài)。本研究探討LIP對(duì)凝血功能的影響，以及線粒體ATP敏感性鉀通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel，mitoKATP)在 LIP心臟保護(hù)中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康♂ Wistar大鼠56只，體質(zhì)量240～270 g〔二級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證許可證號(hào):SCXK(京)2007-0001〕，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.2 主要試劑及儀器 5-羥基癸酸鈉(5-hydroxydecanoate，5-HD)，BioMol，美國(guó);活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)測(cè)定試劑盒，天津美德太平洋科技有限公司;凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)測(cè)定試劑盒，Instrumentation Laboratory Company;纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)測(cè)定試劑盒，F(xiàn)isher Scientific Company L.L.C;2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)，Sigma;原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，Roehe;BP-動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)定儀、BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、HX-300動(dòng)物呼吸機(jī)，成都泰盟科技有限公司;CA-7000全自動(dòng)血液分析儀，Sysmex;2050型自動(dòng)石蠟切片機(jī)，Leica，德國(guó);Bx50F4型光學(xué)顯微鏡，Olympus，日本;HIl220型切片烘干機(jī)，Leica，德國(guó)。

1.3 模型制備［7］

1.3.1 心肌I/R損傷模型 大鼠以25%烏拉坦(1 g·kg－1)腹腔注射麻醉，連續(xù)監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖和血壓。開(kāi)胸，在冠狀動(dòng)脈左前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)下穿線，絲線兩端共同穿過(guò)一末端為球形的聚乙烯小管，形成一活結(jié)。拉緊活結(jié)造成LAD供血區(qū)心肌缺血，放松活結(jié)使心肌恢復(fù)血流灌注。大鼠行LAD結(jié)扎30 min缺血，繼之120 min再灌注。

1.3.2 無(wú)創(chuàng)肢體缺血預(yù)適應(yīng)模型 大鼠以1%戊巴比妥鈉(30 mg·kg－1)腹腔注射麻醉，將改良的動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)試儀自制套管置于大鼠左后肢根部，脈搏傳感器緊貼在足背動(dòng)脈上，應(yīng)用動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)，連續(xù)監(jiān)測(cè)血壓和脈搏。加壓，以脈搏消失、肢體遠(yuǎn)端體溫下降、皮膚發(fā)紺為阻斷股動(dòng)脈標(biāo)志，持續(xù)5 min;減壓，以脈搏出現(xiàn)、肢體遠(yuǎn)端體溫回升、皮膚潮紅為再灌注標(biāo)志，持續(xù)5 min，重復(fù)3個(gè)循環(huán)為1次LIP。每天1次，連續(xù)3 d。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 健康♂ Wistar大鼠56只，隨機(jī)分為4組。

1.4.1 I/R組(n=14) 大鼠連續(xù)3 d腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg·kg－1)。d 4，LAD 經(jīng)歷30 min 缺血/120 min再灌注。于30 min缺血前10 min股靜脈注射與藥物等體積的生理鹽水(normal saline，NS)，并于I/R期間用注射泵恒速靜脈輸入與藥物等體積的NS。

1.4.2 I/R+5-HD 組(n=14)I/R 損傷模型大鼠于d 4 30 min缺血前10 min股靜脈注射5-HD溶液9 mg·kg－1。并于I/R期間用注射泵恒速靜脈輸入5-HD溶液1 mg·kg－1。余同I/R組。

1.4.3 LIP組(n=14)LIP模型大鼠每天經(jīng)歷3次左后肢5 min缺血/5 min再灌注，連續(xù)3 d。d 4對(duì)心臟LAD實(shí)施30 min缺血/120 min再灌注。余同I/R組。

1.4.4 LIP+5-HD 組(n=14)LIP 模型大鼠每天經(jīng)歷3次左后肢5 min缺血/5 min再灌注，連續(xù)3 d。d 4對(duì)心臟LAD實(shí)施30 min缺血/120 min再灌注。余同I/R+5-HD組。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 血壓與心率 在大鼠LAD結(jié)扎前、LAD結(jié)扎立即、15和30 min以及再灌30、120 min記錄收縮壓、舒張壓和心率，并計(jì)算平均動(dòng)脈壓。

1.5.2 心肌梗死面積 于再灌注120 min末立即結(jié)扎LAD，股靜脈注射0.6%臺(tái)盼藍(lán)2 ml。迅速取下心臟，洗凈殘血，－20℃冰箱冷凍20 min。由心尖部向心基部將心臟切成1mm厚切片，未被藍(lán)染的為危險(xiǎn)區(qū)(area at risk，AAR)，將其進(jìn)行1%TTC染色20 min，瀕死區(qū)心肌組織被染為磚紅色，梗死區(qū)(infarct size，IS)為灰白色，用10%福爾馬林溶液固定標(biāo)本，將IS從AAR中分離出來(lái)，電子天平稱重，以IS占AAR重量的百分比(IS/AAR%)計(jì)算梗死面積。

1.5.3 心肌細(xì)胞凋亡 于再灌注120 min末，迅速剪下心臟，NS洗凈殘血。將靠近心尖部分的心肌組織置10%福爾馬林中固定，心肌組織切片常規(guī)脫蠟水化，按TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡陽(yáng)性心肌細(xì)胞核呈棕黃色。每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野(400×)中的凋亡陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)和總細(xì)胞核數(shù)，各取其平均值，以凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)之比計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

1.5.4 HE染色觀察心肌形態(tài) 上述石蠟切片行HE染色，定性觀察心肌形態(tài)學(xué)改變。

1.5.5 凝血功能 各組于缺血前和再灌注120 min末由股靜脈取血1 ml，置于含有3.8%檸檬酸鈉的試管中(抗凝劑與全血的體積比為1∶9)，立即混勻。以400×g的速度離心10 min，收集血漿，按FIB、PT、APTT檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 血壓與心率 缺血后，各組的平均動(dòng)脈壓和心率均呈降低趨勢(shì)，再灌注后有所回升，但均低于缺血前水平，各組間各時(shí)點(diǎn)差異無(wú)顯著性。

2.2 心肌梗死面積 各組AAR差異無(wú)顯著性。與I/R組相比，I/R+5-HD組IS和IS/AAR比值差異無(wú)顯著性，說(shuō)明5-HD自身對(duì)心肌梗死面積無(wú)影響;LIP組IS明顯縮小約40%(P＜0.01);IS/AAR比值明顯降低約38.24%(P＜0.05)。而5-HD取消LIP縮小心肌梗死面積的作用。見(jiàn)Fig 1。

Fig 1 Effects of various interventions on myocardial infarctsize during I/R in rats(n=8)

2.3 心肌細(xì)胞凋亡 I/R組和I/R+5-HD組AI差異無(wú)顯著性，說(shuō)明5-HD自身對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)影響。與I/R組比較，LIP組 AI降低約 23.33%(P＜0.01)，此作用被5-HD取消。見(jiàn)Fig 2。

2.4 心肌形態(tài) I/R組、I/R+5-HD組、LIP+5-HD組心肌纖維橫紋消失，肌束斷裂，心肌細(xì)胞混濁變性，大部分心肌細(xì)胞膜不完整，胞質(zhì)嗜酸性變，細(xì)胞核溶解消失，大量紅細(xì)胞滲出及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。LIP組心肌纖維橫紋、心肌細(xì)胞核膜較清晰，偶見(jiàn)肌束斷裂，大部分心肌細(xì)胞膜完整，少量紅細(xì)胞滲出及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)Fig 3。

Fig 2 Effects of various interventions on cardiocyte apoptosis during I/R in rats(n=6)

Fig 3 Effects of various interventions on myocardial morphousduring I/R in rats(HE staining，×400)

2.5 凝血功能

2.5.1 FIB LIP對(duì)血漿FIB無(wú)影響。I/R后，F(xiàn)IB均明顯增加(P＜0.01)。I/R組和I/R+5-HD組之間差異無(wú)顯著性，說(shuō)明5-HD自身對(duì)FIB無(wú)影響。LIP組FIB明顯低于I/R組約12.5%(P＜0.05)。5-HD取消LIP降低FIB升高程度的作用。見(jiàn)Fig 4。2.5.2 PT 30 min缺血前各組大鼠PT差異無(wú)顯著性。I/R后，各組PT均延長(zhǎng)，但各組間差異無(wú)顯著性。見(jiàn)Fig 5。

2.5.3 APTT 與30 min缺血前比較，各組 APTT無(wú)變化。見(jiàn)Fig 6。

3 討論

本研究結(jié)果表明，LIP可縮小心肌梗死面積，減少心肌細(xì)胞凋亡，改善心肌形態(tài)學(xué)損傷，降低FIB在I/R后的增加幅度，上述保護(hù)作用被5-HD取消，提示mitoKATP可能參與介導(dǎo)LIP的心臟保護(hù)作用。

Fig 4 Effects of various interventions onconcentration of FIB in rats(n=8)

Fig 5 Effects of various interventions on PT in rats(n=8)

Fig 6 Effects of various interventions on APTT in rats(n=8)

LIP心臟保護(hù)作用機(jī)制尚不明確，可能涉及神經(jīng)、體液調(diào)節(jié)機(jī)制或者兩者的共同作用［8－9］。腺苷、阿片類(lèi)物質(zhì)、ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)、內(nèi)源性大麻素類(lèi)、熱休克蛋白等均有報(bào)道可能參與LIP的心臟保護(hù)作用。KATP存在兩種類(lèi)型，分別位于線粒體和細(xì)胞膜上。5-HD曾被認(rèn)為是mitoKATP的特異性阻斷劑，但近年來(lái)的研究提示5-HD還可阻斷膜KATP，并影響內(nèi)源性脂肪酸的 β-氧化過(guò)程［10－11］。Schmidt等［12］在豬的 I/R模型中，發(fā)現(xiàn)對(duì)肢體進(jìn)行遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)可以減緩惡性的心律失常，減少心肌梗死面積，對(duì)心臟起到保護(hù)作用，而mitoKATP抑制劑格列本脲可以消除其保護(hù)作用，提示mitoKATP開(kāi)放是關(guān)鍵作用。但Zhao等［13］發(fā)現(xiàn)，小豬的肢體遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)I/R的保護(hù)作用與細(xì)胞膜上的KATP關(guān)系密切，而非mitoKATP。Wu等［14］在大鼠無(wú)創(chuàng)延遲肢體缺血預(yù)適應(yīng)中發(fā)現(xiàn)，5-HD可以取消LIP縮小心肌梗死面積、緩解惡性室性心律失常等保護(hù)作用。本研究表明LIP可縮小心肌梗死面積，減少心肌細(xì)胞凋亡，改善心肌形態(tài)學(xué)損傷，LIP的心臟保護(hù)作用被5-HD取消，提示KATP的開(kāi)放可能在LIP心臟保護(hù)中具有重要的調(diào)節(jié)作用，但鑒于5-HD作用的復(fù)雜性，需在后續(xù)研究中使用特異性阻斷劑判斷起關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用的KATP類(lèi)型。

本課題組前期對(duì)LIP對(duì)纖溶系統(tǒng)的影響進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)LIP能明顯對(duì)抗血漿中組織型纖溶酶原激活劑的降低和纖溶酶原激活劑抑制物－1活性的升高，推測(cè)LIP能糾正心肌I/R時(shí)纖溶活性降低的狀態(tài)，抑制血栓的形成從而保護(hù)心?。?5］。本研究對(duì)凝血指標(biāo)進(jìn)行初步檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)LIP對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)下的凝血功能無(wú)影響，但能降低I/R后血漿FIB增加程度。提示LIP可能通過(guò)減少FIB，防止或減少血栓形成，改善血流動(dòng)力學(xué)，減輕I/R損傷。此作用被5-HD取消，提示KATP可能參與其中，機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

［1］ Karuppasamy P，Chaubey S，Dew T，et al.Remote intermittent ischemia before coronary artery bypass graft surgery:A strategy to reduce injury and inflammation［J］?Basic Res Cardiol，2011，106(4):511－9.

［2］ Peters J.Remote ischaemic preconditioning of the heart:remote questions，remote importance，or remote preconditioning［J］?.Basic Res Cardiol，2011，106(4):507 － 9.

［3］ Kottenberg E，Musiolik J，Thielmann M，et al.Interference of propofol with signal transducer and activator of transcription 5 activation and cardioprotection by remote ischemic preconditioning during coronary artery bypass grafting［J］.J Thorac Cardiovasc Surg，2013，Mar 1，［Epub ahead of print］

［4］ Maslov L N，Lishmanov L B.Neuroprotective effect of ischemic postconditioning and remote preconditioning.Prospective of clinical use［J］.Angiol Sosud Khir，2012，18(2):27 －34.

［5］ 余 超，劉 進(jìn).遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理對(duì)腦缺血保護(hù)作用的研究進(jìn)展［J］.華西醫(yī)學(xué)，2013，28(2):298－301.

［5］ Yu C，Liu J.Recent advances of protection in remote ischemia preconditioning against cerebral ischemia［J］.West China Med J，2013，28(2):298－301.

［6］ Li S J，Wu Y N，Kang Y，et al.Noninvasive limb ischemic preconditioning protects against myocardial I/R injury in rats［J］.J Surg Res，2010，164(1):162 －8.

［7］ 李淑娟，吳艷娜，康 毅，等.無(wú)創(chuàng)性肢體缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠心肌缺血/再灌損傷后心肌凋亡的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(11):100－4.

［7］ Li S J，Wu Y N，Kang Y，et al.Effects of limb atraumatic ischemic preconditioning on apoptosis induced by myocardial ischemia reperfusion injury in rats［J］.Chin Phamacol Bull，2009，25(11):100－4.

［8］ Lim S Y，Yellon D M，Hausenloy D J.The neural and humoral pathways in remote ischemic preconditioning［J］.Basic Res Card，2010，105(5):651 －5.

［9］ Przyklenk K，Whittaker P.Remote ischemic preconditioning:Current knowledge，unresolved questions，and future priorities［J］.Cardiovasc Pharmacol Therap，2011，16(3 －4):255 －9.

［10］ Bernardo N L，D'Angelo M，Okubo S，et al.Delayed ischemic preconditioning is mediated by opening of ATP-sensitive potassium channels in the rabbit heart［J］.Am J Physiol，1999，276(4 Pt 2):H1323－30.

［11］ Hanley PJ，Drose S，Brandt U，et al.5-Hydroxydecanoate is metabolised in mitochondria and creates a rate-limiting bottleneck for beta-oxidation of fatty acids［J］.J Physiol，2005，562(Pt2):307－18.

［12］ Schmidt，Smerup M，Konstantinov I E，et al.Intermittent peripheral tissue ischemia during coronary ischemia reduces myocardial infarction through a KATP-dependent mechanism:first demonstration of remote ischemic preconditioning［J］.Physiol Heart Circ Physiol，2007，292(4):H1883 －90.

［13］ Zhao J L，Yang Y J，Pei W D，et al.Remote periconditioning reduces myocardial no-reflow by the activation of KATPchannel via inhibition of Rho-kinase［J］.Int J Cardiol，2009，133(2):179－84.

［14］ Wu Y N，Zhu X H，Yuan H J，et al.Noninvasive delayed limb ischemic preconditioning attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury in rats by a mitochondrial K(ATP)channel-dependent mechanism［J］.Physiol Res，2011，60(2):271 －9.

［15］李淑娟，吳艷娜，康 毅，等.無(wú)創(chuàng)性肢體缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠心肌缺血/再灌損傷后纖溶因子的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(10):1344－7.

［15］ Li S J，Wu Y N，Kang Y，et al.Influence of limb atraumatic ischemic preconditiong on fibrolysis factors in myocardial ischemia/reperfusion injury in rats［J］.Chin Phamacol Bull，2008，24(10):1344－7.