都基峻，曾 萍，石應(yīng)杰，王 清，張 凡

中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院，北京 100012

模擬煙氣條件下野生混合微藻的培養(yǎng)

都基峻，曾 萍，石應(yīng)杰，王 清，張 凡

中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院，北京 100012

開(kāi)發(fā)利用生物質(zhì)能是解決能源緊張和一系列全球環(huán)境問(wèn)題的有效途徑之一.微藻是一種具有發(fā)展前途的新型生物質(zhì)能原料，利用煙氣培養(yǎng)微藻不僅為生物質(zhì)能的開(kāi)發(fā)提供了新的途徑，而且能夠直接削減煙氣CO2的排放，對(duì)于減緩全球氣候變化具有積極意義.以野生混合微藻為對(duì)象，利用模擬煙氣在柱狀光生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)微藻，通過(guò)180 d的培養(yǎng)，考察光照條件和CO2對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響及光照條件對(duì)細(xì)胞粗脂肪含量的影響.結(jié)果表明：馴化后的混合微藻對(duì)CO2具有生理敏感性，煙氣中的CO2可以明顯提高其生長(zhǎng)速率;全天光照可提高微藻生長(zhǎng)速率，并有利于生長(zhǎng)速率和微藻生物量的穩(wěn)定;在微藻生物量和光合有效輻射日總量一定的條件下，全天24 h光照比12 h∶12 h更有利于細(xì)胞粗脂肪的積累.

混合微藻;煙氣;CO2;光照;粗脂肪

隨著全球氣候變化的加劇，削減人為CO2排放量越來(lái)越受到全世界的關(guān)注，開(kāi)發(fā)利用可再生能源生物質(zhì)能、太陽(yáng)能、風(fēng)能和水能等)是解決這一全球性環(huán)境問(wèn)題的有效途徑［1］.目前生物質(zhì)能是最主要的可再生能源，在德國(guó)生物質(zhì)能已占到可再生能源的一半以上［2］.但現(xiàn)階段所使用的生物質(zhì)能通常以陸生植物為原料，如大豆、玉米和油桐等，由于該類(lèi)原料存在價(jià)格高、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、運(yùn)輸儲(chǔ)存困難、與糧食飼料作物爭(zhēng)地等缺點(diǎn)，不利于生物質(zhì)能的大規(guī)模開(kāi)發(fā)，因此生物質(zhì)能的發(fā)展還需要尋找新型原料.

微藻是一類(lèi)分布極廣的低等自養(yǎng)生物，對(duì)環(huán)境條件要求不高，適應(yīng)能力強(qiáng)［3］，具有細(xì)胞增殖快、光能利用率高、生物產(chǎn)量高及不受土地條件限制等優(yōu)點(diǎn)［4］，并且許多微藻能夠耐受高濃度的CO2，因此微藻不僅是一種具有發(fā)展前途的生物質(zhì)能原料，而且還能在削減固定源 CO2排放［5-6］和廢水處理方面［7-8］發(fā)揮作用.

自20世紀(jì)70年代起，發(fā)達(dá)國(guó)家就開(kāi)始重視和資助有關(guān)微藻生物固碳技術(shù)的研究［9-10］.GORDANA等［11-12］研究認(rèn)為，氣升式光反應(yīng)器適宜培養(yǎng)微藻;DOUSKOVA等［13-14］采用純培養(yǎng)綠藻吸收 CO2;HSUEH等［15］采用純化的溫泉微藻吸收 CO2;DOUCHA等［16］開(kāi)展了煙氣培養(yǎng)微藻的中試研究和技術(shù)經(jīng)濟(jì)比較.國(guó)內(nèi)岳麗宏等［17］在煙氣培養(yǎng)微藻方面開(kāi)展了探索性研究.

雖然微藻固碳技術(shù)逐漸受到人們的關(guān)注，但是國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究報(bào)道還較少，技術(shù)也并不成熟.目前已開(kāi)展的研究均采用純培養(yǎng)的單一微藻，但根據(jù)已有的工業(yè)化試驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室培育出的純培養(yǎng)單一藻種在大規(guī)模培養(yǎng)后往往競(jìng)爭(zhēng)不過(guò)野生藻種［9］，這直接影響了該技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用，因此有必要從競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)的野生微藻中篩選、馴化出適宜的混合藻種，并針對(duì)其開(kāi)展微藻固碳技術(shù)研究.筆者以野生混合微藻為對(duì)象，利用模擬煙氣在氣升式柱狀光生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)微藻，通過(guò)180 d的培養(yǎng)，初步考察光照條件和CO2對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響及光照條件對(duì)細(xì)胞粗脂肪含量的影響，為進(jìn)一步研究微藻處理煙氣中CO2的工藝提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 藻種

微藻取自江蘇省太湖和北京北海，藻種混合后先用約10%(體積分?jǐn)?shù))的CO2馴化約15 d，而后裝入反應(yīng)器.經(jīng)鏡檢，馴化后的混合微藻中優(yōu)勢(shì)種主要為適應(yīng)氮豐富環(huán)境的斜生柵藻［18］和小球藻.

1.2 反應(yīng)器

采用2套(1#和2#)相同的柱狀光生物反應(yīng)器，材質(zhì)為普通有機(jī)玻璃，高1 000 mm，內(nèi)徑70 mm.反應(yīng)器自底部起每隔200 mm設(shè)置藻液排出口，并用球閥來(lái)控制藻液排出與否.空氣和CO2氣體混合后由曝氣頭鼓入藻液.日光燈開(kāi)啟時(shí)間由定時(shí)器控制.反應(yīng)器和培養(yǎng)系統(tǒng)如圖1所示.

圖1 微藻培養(yǎng)系統(tǒng)示意圖Fig.1 The schema ofm icroalgae cultivation system

1.3 培養(yǎng)液

培養(yǎng)液 A：2 g/L NH4Cl，0.2 g/L CaCl2·2H2O，0.23 g/L KH2PO4，0.2 g/L NaHCO3，0.25 g/L MgSO4·7H2O.

培養(yǎng)液 B：4 g/L NH4Cl，0.4 g/L CaCl2·2H2O，0.45 g/L KH2PO4，0.4 g/L NaHCO3，0.5 g/L MgSO4·7H2O，微藻培養(yǎng)液用水均為煮沸后冷卻的自來(lái)水.

1.4 溫度和pH

使用電加熱棒加熱藻液，使藻液溫度維持在25～35℃.培養(yǎng)條件下藻液 pH始終保持在 6.5左右.

1.5 曝氣條件

培養(yǎng)期間完全曝氣，曝氣量控制在400～600 m L/min.

1.6 光照條件

試驗(yàn)用光源為36 W日光燈管2組，每組4根，豎直分布于反應(yīng)器四周.光照條件1：用1組燈管，全天24 h光照，其光合有效光量子密度見(jiàn)表1.光照條件2：用2組燈管，每天光照12 h后再黑暗12 h，即光暗周期為12 h∶12 h，其光合有效光量子密度見(jiàn)表1.

表1 不同光照條件下的光合有效光量子密度Table 1 Photon flux density in different illum ination μmol/(m2·s)

1.7 測(cè)量方法

1.7.1 ρ(微藻)

采用質(zhì)量法：取慢速定量濾紙?jiān)?05℃下烘干1 h稱(chēng)質(zhì)量(m1).取70 m L混合微藻液以2 800 r/m in離心5 m in，除去大部分上清液，剩余清液和微藻搖勻，再用慢速濾紙進(jìn)行過(guò)濾，濾渣連同濾紙?jiān)?05℃下烘干1.5 h后稱(chēng)質(zhì)量(m2).m2與m1差值即為每70 m L中所含微藻質(zhì)量(以干質(zhì)量計(jì))，除以藻液體積后得到混合液的ρ(微藻).測(cè)2組平行樣，結(jié)果取平均值.

1.7.2 微藻細(xì)胞密度

采用血球計(jì)數(shù)板法對(duì)樣品中所有微藻進(jìn)行計(jì)數(shù).具體操作：取少量培養(yǎng)的藻液根據(jù)大致生長(zhǎng)量稀釋混勻后制片，按血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法計(jì)4個(gè)角和中間5個(gè)中格的微藻細(xì)胞數(shù)量.

細(xì)胞密度(m L-1)=(細(xì)胞總數(shù)/80)×400×1 000×稀釋倍數(shù)

1.7.3 φ(CO2)

使用GXH-3010E1紅外線(xiàn) CO2分析儀(北京市華云分析儀器研究所生產(chǎn))，儀器測(cè)量范圍為0～20%.由于待測(cè)氣體濕度較高，因此在進(jìn)入儀器前，先通過(guò)置于冰水混合物中的冷凝干燥管，以除去部分水分，防止水分凝結(jié)在儀器的光路內(nèi)影響分析結(jié)果.

1.7.4 光照強(qiáng)度

使用TBQ-5光合有效輻射傳感器(錦州陽(yáng)光科技發(fā)展有限公司生產(chǎn))和QTC-4全天候光輻數(shù)據(jù)自記儀(錦州陽(yáng)光科技發(fā)展有限公司生產(chǎn))分別對(duì)反應(yīng)器上、中、下部的前、后、左、右方進(jìn)行測(cè)量，取平均值.

1.7.5 w(粗脂肪)

采用索氏提取法測(cè)量混合微藻的 w(粗脂肪)，所用有機(jī)溶劑為30～60℃的石油醚.

2 結(jié)果

2.1 CO2對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響

圖2，3分別為不同φ(CO2)下ρ(微藻)和微藻細(xì)胞密度隨培養(yǎng)時(shí)間的變化曲線(xiàn)，1#和2#反應(yīng)器均采用微藻培養(yǎng)液 B，但是1#反應(yīng)器通入空氣，2#通入φ(CO2)為 10% 的 CO2.由圖 2，3可知，在 10%CO2下的ρ(微藻)、微藻細(xì)胞密度及二者的增長(zhǎng)速率都顯著高于空氣，說(shuō)明CO2明顯促進(jìn)了微藻的增長(zhǎng).由圖2估算可知，通入CO2條件下的微藻平均生長(zhǎng)速率約為121.1 mg/(L·d)，而通入空氣下的平均生長(zhǎng)速率只有30.8 mg/(L·d)，表明通入10% 的CO2可將微藻的生長(zhǎng)速率提高3倍.

2.2 光照條件對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響

圖4為不同光照條件下1#和2#反應(yīng)器內(nèi)ρ(微藻)的變化曲線(xiàn).表2為2個(gè)反應(yīng)器內(nèi)微藻在不同光照條件下的比生長(zhǎng)速率，其中1#反應(yīng)器采用培養(yǎng)液A，2#反應(yīng)器采用培養(yǎng)液B.由表1可知，2種條件下的光合有效輻射日總量基本持平.

圖2 不同 φ(CO 2)下 ρ(微藻)的變化Fig.2 Profiles ofmicroalgae mass concentration at different CO2 concentrations

圖3 不同φ(CO 2)下微藻細(xì)胞密度的變化Fig.3 Profiles ofmicroalgae cell density at different CO2 concentrations

圖4 不同光照條件下ρ(微藻)的變化Fig.4 M icroalgae mass concentrations in different illumination

從圖4可以看出，光照條件改變前后，1#和2#反應(yīng)器內(nèi)ρ(微藻)基本持平，但在采用光暗交替的光照條件下，ρ(微藻)波動(dòng)明顯增大.從圖5可以看出，光暗交替條件使得1#和2#反應(yīng)器內(nèi)微藻比生長(zhǎng)速率都發(fā)生了明顯下降，其中2#反應(yīng)器在光照條件1下生長(zhǎng)速率為0.21 d-1，而在光照條件2下降為0.12 d-1，1#反應(yīng)器也由 0.20 d-1降為 0.11 d-1;而且從微藻比生長(zhǎng)速率的變化趨勢(shì)來(lái)看，光暗交替條件下比生長(zhǎng)速率的波動(dòng)較連續(xù)光照條件下更大.因此在光輻射總量不變的情況下，全天光照更有利于培養(yǎng)液微藻生物量和生長(zhǎng)速率穩(wěn)定在較高水平上.

表2 2種光照條件下微藻比生長(zhǎng)速率Table 2 Microalgae specific growthrate in different illumination

圖5 不同光照條件下微藻比生長(zhǎng)速率變化Fig.5 Microalgae specific growthrate in different illumination

2.3 光照條件對(duì)w(粗脂肪)的影響

表3對(duì)比了不同光照條件下微藻細(xì)胞w(粗脂肪)，其中1#反應(yīng)器采用培養(yǎng)液A，2#反應(yīng)器采用培養(yǎng)液B.從表3可以看出，在全天光照條件下w(粗脂肪)略高于光暗交替條件，說(shuō)明全天光照情況下可能更有利于微藻細(xì)胞積累脂肪.

表3 微藻細(xì)胞中w(粗脂肪)Table 3 Crude fat ofmicroalgae

3 討論

3.1 CO2的影響

通常煙氣中φ(CO2)在10%左右，遠(yuǎn)高于環(huán)境中的φ(CO2)(0.03%)，因此 CO2對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響是首要考慮的問(wèn)題.根據(jù)已有的研究，微藻Scenedesmus dimorphus在φ(CO2)為 33.3%時(shí)，生長(zhǎng)速率達(dá)到最大值［17］，而微藻 Chlorella vulgaris最佳生長(zhǎng)的φ(CO2)為 5%［19］，并且在φ(CO2)小于 15%的情況下生長(zhǎng)良好.需要指出的是，該研究中的藻種在φ(CO2)為10%的條件下生長(zhǎng)速率約為空氣條件下的4倍，遠(yuǎn)大于上述研究的生長(zhǎng)速率增幅(在最佳生長(zhǎng)條件下，生長(zhǎng)速率為空氣條件下的1.2～1.3倍).可能的原因如下：①藻種事先已經(jīng)在φ(CO2)為10%的條件下進(jìn)行了馴化;②混合藻種具有更強(qiáng)的適應(yīng)能力.

此外有研究發(fā)現(xiàn)，已適應(yīng)高φ(CO2)環(huán)境的小球藻，在不通入CO2后，生長(zhǎng)速率明顯降低［20］，這從側(cè)面上也印證了試驗(yàn)結(jié)果.因此可以認(rèn)為，馴化條件對(duì)微藻碳源需求量的影響十分重要，即使在培養(yǎng)初期ρ(微藻)不高的情況下，碳源不足仍會(huì)在很大程度上限制已馴化藻種的生長(zhǎng)，這可能是因?yàn)轳Z化后的微藻對(duì)相應(yīng)φ(CO2)具有生理敏感性，低于該φ(CO2)氣體或被感知為碳缺乏，不利于其生長(zhǎng)速率的提高.

3.2 光照條件的影響

在光照條件對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響方面，MOHEIMANI等［21］的研究發(fā)現(xiàn)，高強(qiáng)度光照下易獲得高光合效率;而MIRóN等［22］研究認(rèn)為，當(dāng)培養(yǎng)到達(dá)指數(shù)生長(zhǎng)期后，光照受限，細(xì)胞為黑暗期作準(zhǔn)備會(huì)盡可能多地儲(chǔ)存能量物質(zhì)(如碳水化合物和脂肪等)，所以低光照對(duì)于提高微藻細(xì)胞的粗脂肪含量有利.因此，在光照強(qiáng)度的選擇上很難同時(shí)滿(mǎn)足生長(zhǎng)速率和脂肪積累的要求.

該研究的結(jié)果表明，在微藻生物量和光輻射總量一定的情況下，全天24 h光照比12 h∶12 h更有利于微藻細(xì)胞粗脂肪的積累.這可能是由于光暗交替條件下，雖然光照強(qiáng)度較高，但由于高光照強(qiáng)度下生物量也較多，光線(xiàn)不易透過(guò)，一定程度上削弱了有效的光照強(qiáng)度，而且在黑暗周期內(nèi)微藻細(xì)胞還可能消耗掉已合成的粗脂肪;反之，低光照強(qiáng)度下的盡管光強(qiáng)不高，但光照時(shí)間更長(zhǎng)，光合作用的時(shí)間也長(zhǎng)，粗脂肪含量反而更高.因此，研究結(jié)果表明，在微藻生物量一定的情況下，減少黑暗時(shí)間更有利于為細(xì)胞粗脂肪的積累.

4 結(jié)論

a.在微藻培養(yǎng)初期補(bǔ)充CO2可以明顯縮短微藻的適應(yīng)期，提高其生長(zhǎng)速率，特別對(duì)于已用一定φ(CO2)馴化的微藻，效果更明顯.

b.全天光照能夠提高微藻生長(zhǎng)速率，并有利于生長(zhǎng)速率和微藻生物量的穩(wěn)定.

c.在微藻生物量和光輻射總量一定的情況下，全天24 h光照比12 h∶12 h更有利于細(xì)胞中粗脂肪的積累.

［1］ DEMIRBASM F，BALAT M，BALAT H.Potential contribution of biomass to the sustainable energy development［J］.Energy Conversion and Management，2009，50(7)：1746-1760.

［2］ MISCHA B，DANYEL R.德國(guó)推進(jìn)可再生能源良治研究［J］.環(huán)境科學(xué)研究，2006，19(S1)：109-120.

［3］ 周群英，高廷耀.環(huán)境工程微生物學(xué)［M］.北京：高等教育出版社，2005：62.

［4］ DE SCHAMPHELAIRE L，VERSTRAETE W.Revival of the biological sunlight-to-biogas energy conversion system ［J］.Biotechnology and Bioengineering，2009，103(2)：296-304.

［5］ SKJANES K， LINDBLAD P， MULLER J.BioCO2： a multidisciplinary，biological approach using solar energy to capture CO2while producing H2and high value products［J］.Biomolecular Engineering，2007，24(4)：405-413.

［6］ CHAE S R，HWANG E J，SHIN H S.Single cell protein production of Euglena gracilis and carbon dioxide fixation in an innovative photo-bioreactor［J］.Bioresource Technology，2006，97(2)：322-329.

［7］ 劉玉環(huán)，阮榕生，孔慶學(xué)，等.利用市政廢水和火電廠煙道氣大規(guī)模培養(yǎng)高油微藻［J］.生物加工過(guò)程，2008，6(3)：29-33.

［8］ 孟睿，何連生，席北斗，等.利用菌 -藻體系凈化水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水［J］.環(huán)境科學(xué)研究，2009，22(5)：511-515.

［9 ］ SHEEHAN J，DUNAHAY T，BENEMANN J，et al.Alook back at the U.S.department of energy's aquatic species program：biodiesel from algae［R］.Golden： The National Renewable Energy Laboratory，1998：11-19.

［10］ UM B H，KIM Y S.Review：a chance for Korea to advance algalbiodiesel technology［J］.Journal of Industrial and Engineering Chemistry，2009，15(1)：1-7.

［11］ GORDANA V N，YOOJEONG K，WU X X，et al.Air-lift bioreactors for algal growth on flue gas：mathematical modeling and pilot-plant studies［J］.Ind Eng Chem Res，2005，44：6154-6163.

［12］ WU X，MERCHUK J C.Simulation of algae growthin a bench scale internalloop airlift reactor［J］.Chem Eng Sci，2004，59(14)：2899-2912.

［13］ DOUSKOVA I，DOUCHA J，LIVANSKY K，et al.Simultaneous flue gas bioremediation and reduction of microalgal biomass production costs［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2009，82(1)：179-185.

［14］ JIN H F，LIM B R，LEE K.Influence of nitrate feeding on carbon dioxide fixation bymicroalgae［J］.JEnviron Sci Health A，2006，41(12)：2813-2824.

［15］ HSUEH H T，CHU H，YU S T.A batch study on the bio-fixation of carbon dioxide in the absorbed solution from a chemical wet scrubber by hot spring and marine algae［J］.Chemosphere，2007，66(5)：878-886.

［16］ DOUCHA J，STRAKA F，LIVANSKY K.Utilization of flue gas for cultivation ofmicroalgae(Chlorella sp.)in an outdoor open thinlayer photobioreactor［J］.Journal of Applied Phycology，2005，17(5)：403-412.

［17］ 岳麗宏，陳寶智，王黎，等.固定煙道氣溫室氣體的微藻的分離及培養(yǎng)特性測(cè)定［J］.東北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，23(3)：289-292.

［18］ 許海，楊林章，劉兆普.銅綠微囊藻和斜生柵藻生長(zhǎng)的氮營(yíng)養(yǎng)動(dòng)力學(xué)特征［J］.環(huán)境科學(xué)研究，2008，21(1)：69-73.

［19］ YUN Y S，LEE S B，PARK JM，et al.Carbon dioxide fixation by algal cultivation using wastewater nutrients［J］.Journal of Chemical Technology ＆ Biotechnology，1997，69：451-455.

［20］ 張栩，戢涌騁，周百成.氣升式藻類(lèi)光生物反應(yīng)器的應(yīng)用研究［J］.海洋科學(xué)，2000，24(5)：14-17.

［21］ MOHEIMANI M R.The culture of coccolithophorid algae for carbon dioxide bioremediation［D］.Perth：Murdoch University，2005.

［22］ MIRóN A S，CERóN GARC′IA M C，CAMACHO F G，et al.Growth and biochemical characterization of microalgal biomassproduced in bubble column and airlift photobioreactors：studies in fed-batch culture［J］.Enzyme and Microbial Technology，2002，31：1015-1023.

Cultivation ofW ild M ixed M icroalgae by Synthetic Flue Gas

DU Ji-jun，ZENG Ping，SHIYing-jie，WANG Qing，ZHANG Fan
hinese Research Academy of Environmental Sciences，Beijing 100012，China

Developing bioenergy is one of the availableways to alleviate the energy crisis and mitigate global climate change.Microalgaere a new form of bioenergy and have a great future.Cultivation ofmicroalgae by synthetic flue gas provides a new strategy to develop ioenergy and directly decreases CO2em ission in the flue gas，which has significant impact on climate change.This paper studied the ultivation of wild mixed microalgae using synthetic flue gas in a column photo reactor.The effects of carbon dioxide concentration，onditions of illumination on the grow th ofmicroalgae as well as the crude fat content in microalgae were investigated during 180 days'ultivation.Theresults showed that the acclimated mixed m icroalgae were sensitive to CO2.Themicroalgae growthrate could be greatly nhanced by feeding with CO2compared with the ones fed with air.Continuous illumination for 24 h was beneficial form icroalgae growth nd stability of growthrate.Under the conditions of samemicroalgae biomass and daily photosynthetic activeradiation，the accumulation f crude fatwould benefit from decreased radiation intensity and increased illumination time.

mixed m icroalgae;flue gas;carbon dioxide;illumination;crude fat

X51

A

1001-6929(2010)03-0366-05

2009-07-31

2009-11-17

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專(zhuān)項(xiàng)(2007KYYW 38)

都基峻(1974-)，男，遼寧錦州人，副研究員，博士，主要從事大氣污染控制研究，dujijun2007@163.com.

(責(zé)任編輯：孫彩萍)