李 薇，吳 婷

（廣州市藥品檢驗(yàn)所藥理室，廣東廣州 510160）

葛根素是從豆科植物野葛干燥根中提取的單體，為異黃酮類化合物，臨床及基礎(chǔ)研究證明，該藥具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈和腦血管、降低心肌耗氧量、改善心肌收縮功能、促進(jìn)血液循環(huán)等藥理作用[1-2]，臨床上現(xiàn)已用于治療心腦血管及外周血管疾病[3-4]。該品種國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-（X-388-1）-2003Z進(jìn)行熱原檢查[5]，未進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。為考察該品種是否可以用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法來代替熱原檢查法，本文參照《中國(guó)藥典》2005年版二部附錄收載的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法對(duì)注射用葛根素進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查研究。

1 儀器與試藥

注射用葛根素（批號(hào)：08020301，規(guī)格：0.2 g/瓶，華北制藥集團(tuán)制劑有限公司；批號(hào)：20061222，200712131，規(guī)格：100 mg/瓶，北京賽生藥業(yè)有限公司；批號(hào)：20060522，200711303，規(guī)格：50 mg/瓶，北京賽生藥業(yè)有限公司；批號(hào)：07102801，規(guī)格：0.4 g/瓶，山東瑞陽制藥有限公司；批號(hào)：07121101，規(guī)格：0.2 g/瓶，山東瑞陽制藥有限公司；批號(hào)：07100401，規(guī)格：0.1 g/瓶，山東瑞陽制藥有限公司；批號(hào)：07091602，規(guī)格：50 mg/瓶，山東瑞陽制藥有限公司）；鱟試劑（批號(hào)：0807022，規(guī)格：0.1 ml/支，標(biāo)示靈敏度：0.25 EU/ml，湛江安度斯生物有限公司；批號(hào)：080506，081012，規(guī)格：0.1 ml/支，標(biāo)示靈敏度：0.25 EU/ml，廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司鱟試劑）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：150601-200860，規(guī)格：160 EU/支，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（批號(hào)：0801180，規(guī)格：50 ml/支，湛江安度斯生物有限公司）；漩渦振蕩器（IKA-MS-1）；恒溫水浴箱（德國(guó) Julabo 19A）。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑標(biāo)示靈敏度的復(fù)核[6-7]

根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值，將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用BET水溶解，在漩渦振蕩器上混勻15 min，然后制成2.00λ、1.00λ、0.50λ 和 0.25λ 4個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按《中國(guó)藥典》2005年版二部附錄的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定，對(duì)湛江安度斯生物有限公司和廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司兩個(gè)廠家的鱟試劑進(jìn)行靈敏度的復(fù)核，鱟試劑靈敏度的測(cè)定值（λc）=lg-1（∑X/4），式中 X 為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg），結(jié)果見表1。3批鱟試劑靈敏度分別為0.25 EU/ml、0.25 EU/ml和0.42 EU/ml，均在 0.5 λ～2.0 λ 范圍之間，表明 3 批鱟試劑靈敏度均符合規(guī)定，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果Tab.1 The results of tachypleus amebocyte lysate sensitivity test

2.2 注射用葛根素的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定[6-7]

按《中國(guó)藥典》2005年版二部中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的規(guī)定確定細(xì)菌內(nèi)毒素限值。根據(jù)公式L=K/M，式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，K為按規(guī)定的給藥途徑，人用每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑K=5 EU/（kg·h），M為人用每公斤體重每小時(shí)的最大供試品劑量，人均體重按60 kg計(jì)算，注射時(shí)間若不足1 h，按1 h計(jì)算。

從注射用葛根素的產(chǎn)品使用說明書可知本品的最大用藥劑量為600 mg，人均體重以60 kg計(jì)，滴注時(shí)間按1 h計(jì)算，則M=600 mg/60 kg·h=10 mg/（kg·h），L=K/M=[5 EU/（kg·h）]/[10 mg/（kg·h）]=0.5 EU/mg。本品為心血管藥、兒童老人用藥，根據(jù)《注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則（修訂稿）》的要求安全系數(shù)定為3，本品內(nèi)毒素最終確定限值為L(zhǎng)=0.17 EU/mg。

2.3 注射用葛根素的干擾預(yù)試驗(yàn)稀釋倍數(shù)的確定[8-9]

目前用于藥品檢驗(yàn)的市售鱟試劑靈敏度（λ）一般在0.50～0.03 EU/mg范圍內(nèi)，最小有效稀釋濃度 c=λ/L，L=0.17 EU/mg，故注射用葛根素進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)時(shí)，0.50～0.03 EU/mg的鱟試劑相對(duì)應(yīng)的最小有效稀釋濃度為3.00、1.50、0.75、0.38、0.18 mg/ml。

2.4 干擾預(yù)試驗(yàn)試驗(yàn)[8-9]

取 3 批注射用葛根素（批號(hào)：08020301，規(guī)格：0.2 g/瓶；批號(hào)：200711303，規(guī)格：50 mg/瓶；批號(hào)：07121101，規(guī)格：0.2 g/瓶）各1瓶，分別加BET水適量溶解，制成50 mg/ml的供試品原液，用BET水將供試品原液進(jìn)行倍比稀釋，制得3.00、1.50、0.75、0.38、0.18 mg/ml共5個(gè)濃度梯度的溶液，將此系列濃度溶液標(biāo)記為供試品管（NPC系列），用上述稀釋液作為溶劑，溶解并稀釋細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，制得每個(gè)稀釋度中細(xì)菌內(nèi)毒素含量均為2 λ（0.5 EU/ml）的注射用葛根素溶液，標(biāo)記此系列溶液為供試品陽性對(duì)照管（PPC系列）。取靈敏度為0.25 EU/ml的湛江安度斯生物有限公司和廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司兩個(gè)不同廠家的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn)，每一稀釋度做2管，同時(shí)按常規(guī)分別設(shè)細(xì)菌內(nèi)毒素陽性對(duì)照（PC）和檢查用水陰性對(duì)照（NC）各2管，結(jié)果見表2。

表2 注射用葛根素干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The results of prerliminary interference test of Puerarin for Injection

由表2結(jié)果可知，所用的3批注射用葛根素稀釋到3.0mg/ml濃度的溶液時(shí)，有2批樣品對(duì)湛江安度斯生物有限公司的鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)有干擾作用，稀釋到1.5 mg/ml或以下濃度的溶液時(shí)，對(duì)兩個(gè)廠家的鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)無增強(qiáng)或抑制的干擾作用。

2.5 干擾試驗(yàn)[6-7]

用兩個(gè)廠家的鱟試劑（靈敏度為0.25 EU/ml），按《中國(guó)藥典》2005年版二部附錄的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定用BET水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es）和用供試品稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Et）。取3批注射用葛根素（批號(hào)：08020301，200711303，07121101）各 1 瓶，分別加 BET 水適量溶解，制成50 mg/ml的供試品原液，再用BET水稀釋制成濃度為1.5 mg/ml的供試品稀釋液，用BET水和供試品稀釋液將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成 2.00 λ、1.00 λ、0.50 λ、0.25 λ濃度的BET水系列細(xì)菌內(nèi)毒素溶液和供試品稀釋液系列細(xì)菌內(nèi)毒素溶液，每一稀釋濃度重復(fù)4管，同時(shí)用上述供試品稀釋液和BET水各做2管陰性對(duì)照管，按公式計(jì)算BET水和供試品稀釋液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值 （Es和Et），Es=lg-1（∑Xs/4），Et=lg-1（∑Xt/4），結(jié)果見表 3。

表3 注射用葛根素的正式干擾試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The results of interference test of Puerarin for Injection

由表 3 結(jié)果可知，2 λ 管均為陽性，0.50 λ、0.25 λ 管均為陰性，對(duì)于λ=0.25 EU/ml的2組鱟試劑的Es分別為0.25 EU/ml、0.35 EU/ml，Es均在 0.5λ～2.0 λ 范圍內(nèi)，3 批注射用葛根素測(cè)得的 Et均在 0.5 λ～2.0 λ 范圍內(nèi)，Et和 Es的比值在 0.5～2.0范圍內(nèi)，說明注射用葛根素在1.5 mg/ml或以下濃度的溶液對(duì)兩個(gè)不同廠家的鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)無增強(qiáng)或抑制的干擾作用，符合《中國(guó)藥典》2005年版二部對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有效性的規(guī)定，因此可以確定注射用葛根素的最大無干擾濃度為 1.5 mg/ml。

2.6 注射用葛根素的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

取9批注射用葛根素樣品，分別根據(jù)“2.5”項(xiàng)下方法制成供試品稀釋液，使用λ=0.25 EU/ml的兩個(gè)廠家的鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并用此稀釋液將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為2 λ的溶液，作為供試品的陽性對(duì)照，另外以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水建立陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。按 《中國(guó)藥典》2005年版二部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢查，結(jié)果見表4。

由表4結(jié)果可知，陰性對(duì)照管（NC）均為陰性，供試品陽性對(duì)照管（PPC）和陽性對(duì)照管（PC）均為陽性，實(shí)驗(yàn)有效；供試品管（NPC）均為陰性，表明樣品中未檢出細(xì)菌內(nèi)毒素，9批注射用葛根素的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均符合規(guī)定。

3 結(jié)論

3.1 無干擾濃度確定

干擾試驗(yàn)?zāi)康氖窃u(píng)價(jià)樣品濃度對(duì)鱟試劑與內(nèi)毒素凝集反應(yīng)的干擾程度及干擾性質(zhì)，初步篩選出對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾的樣品濃度范圍。本品通過將注射用葛根素稀釋至1.5 mg/ml或以下濃度，消除對(duì)鱟試劑凝集反應(yīng)的干擾。

3.2 鱟試劑的影響

不同廠家的鱟試劑由于生產(chǎn)工藝、質(zhì)量參數(shù)等方面有一定差異，其抗干擾能力存在差異。因此，本實(shí)驗(yàn)采用2個(gè)不同廠家的鱟試劑對(duì)3個(gè)批號(hào)的樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。從正式干擾試驗(yàn)結(jié)果可見，樣品稀釋至1.5 mg/ml濃度時(shí)，Es或Et均在0.5 λ～2.0 λ范圍之內(nèi)，可認(rèn)為注射用葛根素在該濃度下不干擾細(xì)胞內(nèi)毒素檢查。

表4 注射用葛根素細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Tab.4 The results of bacterial endotoxin test of Puerarin for Injection

3.3 檢查結(jié)果

用兩個(gè)廠家鱟試劑與9批樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素限量均在0.17 EU/mg限值以下。因此，注射用葛根素采用限值0.17 EU/mg進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法代替熱原檢查法是可行的。

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